鈣黃綠素是一種鈣依賴型熒光分子。它主要用于研究體內(nèi)條件下的骨代謝，并有助于在 體外條件下對凹陷區(qū)域進(jìn)行染色。鈣黃綠素被用于鈣的熒光測定以及鈣的EDTA（乙二胺四乙酸）滴定。跟著百螢來一起探索鈣黃綠素的相關(guān)問題吧！

問：什么是鈣黃綠素？

答：鈣黃綠素通常用乙酰氧基甲基酯（例如鈣黃綠素 AM）進(jìn)行修飾以促進(jìn)膜通透性，并廣泛用作檢測活細(xì)胞的活力指示劑。 它與幾種藥物相關(guān)的測定有關(guān)，包括細(xì)胞毒性、氧化功能和神經(jīng)毒性。

問：鈣黃綠素,AM如何工作？

答：鈣黃綠素 AM 是鈣黃綠素的乙酰甲氧基衍生物，是一種可透過膜的熒光酯酶底物，用于測定細(xì)胞活力和膜完整性。 鈣黃綠素 AM 的親脂性使其能夠自由擴(kuò)散穿過細(xì)胞膜并滲透到活細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中。 進(jìn)入細(xì)胞后，非特異性細(xì)胞內(nèi)酯酶會酶促去除 AM 基團(tuán)，由此產(chǎn)生的去酯化鈣黃綠素產(chǎn)物會被困在細(xì)胞內(nèi)。 在藍(lán)光激發(fā)下，鈣黃綠素在 521 nm 處發(fā)出明亮的綠色熒光。 鈣黃綠素的熒光強(qiáng)度與細(xì)胞酯酶的活性和樣品中存在的活細(xì)胞數(shù)量成正比。

問：鈣黃綠素,AM 有毒嗎？

答：鈣黃綠素AM的SDS表明它是一種無害物質(zhì)或混合物。在生命科學(xué)和藥物發(fā)現(xiàn)研究中，鈣黃綠素AM由于其相對較低的細(xì)胞毒性，通常用于研究酶活性、細(xì)胞活力、膜完整性和長期細(xì)胞追蹤。然而，對于特定的細(xì)胞系和實驗條件，高濃度的鈣黃綠素AM已被證明對細(xì)胞具有毒性。

問：鈣黃綠素AM是熒光的嗎？

答：不，鈣黃綠素 AM 是一種非熒光酯酶底物。 然而，在活細(xì)胞中，鈣黃綠素 AM 可以被動地穿過細(xì)胞膜并進(jìn)入胞質(zhì)溶膠，從而使非特異性細(xì)胞內(nèi)酯酶水解來自鈣黃綠素 AM 的乙酰氧基甲酯，從而產(chǎn)生高熒光鈣黃綠素產(chǎn)物。 鈣黃綠素分別在 501 nm 和 521 nm 處具有激發(fā)和發(fā)射峰，并在激發(fā)時產(chǎn)生強(qiáng)烈的綠色熒光。 測得的信號強(qiáng)度與起作用的細(xì)胞酯酶的活性和存在的活細(xì)胞數(shù)量成正比。

問：鈣黃綠素AM 可以在細(xì)胞中持續(xù)多久？

答：鈣黃綠素是一種疏水性化合物，可以在具有完整質(zhì)膜的活細(xì)胞中保留數(shù)小時至數(shù)天，具體取決于細(xì)胞類型、細(xì)胞形態(tài)或?qū)嶒灄l件。 在 Miles 等人于 2016 年進(jìn)行的基于細(xì)胞的測定中，載有鈣黃綠素 AM 的前列腺癌細(xì)胞在 0.5、2、6、12、24 和 36 小時標(biāo)記處成像。 在 36 小時標(biāo)記處，細(xì)胞仍然發(fā)出適度的熒光； 然而，背景熒光有所增加（見圖片）。 增加的原因之一是有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (OAT) 對鈣黃綠素的擠壓，OAT 在調(diào)節(jié)陰離子平衡方面起著關(guān)鍵作用。 Probenecid 是一種 OAT 抑制劑，可以添加到鈣黃綠素 AM 工作溶液中，以提高去酯化鈣黃綠素在細(xì)胞內(nèi)的保留并減少干擾。

問：鈣黃綠素AM在染色后可以固定嗎？

答：不能，無論使用何種固定方法 - 醛或甲醇固定 - 用鈣黃綠素 AM 染色的細(xì)胞都會失去其染色效果。 此外，鈣黃綠素 AM 不能用于固定細(xì)胞，因為它們?nèi)狈⑩}黃綠素 AM 轉(zhuǎn)化為鈣黃綠素所需的酯酶以及保留染料所需的膜完整性。 鈣黃綠素 AM 是一種熒光酯酶底物，只能用于活細(xì)胞以確定細(xì)胞活力。如需此類實驗，請千萬注意！

問：鈣黃綠素AM能染色細(xì)菌嗎？

答：鈣黃綠素 AM 染色不僅適用于真核生物樣品，還可用于確定細(xì)菌樣品中的細(xì)胞活力。 Calcein AM 適用于檢測許多活的革蘭氏陰性細(xì)菌菌株，可用于微生物學(xué)研究、環(huán)境監(jiān)測、藥物無菌檢測以及食品和植物評估技術(shù)。 與真核細(xì)胞一樣，細(xì)菌在其細(xì)胞質(zhì)中含有微生物酯酶，可以裂解鈣黃綠素 AM 的親脂性封閉基團(tuán)并將其轉(zhuǎn)化為熒光鈣黃綠素。 可以使用熒光儀器測量信號，其強(qiáng)度與存在的活細(xì)菌數(shù)量成正比。

問：鈣黃綠素是細(xì)胞滲透的嗎？

答：不，鈣黃綠素不具有細(xì)胞滲透性。 鈣黃綠素含有四個羧酸鹽基團(tuán)，使化合物整體帶負(fù)電荷，帶電分子不能通過簡單的擴(kuò)散穿過細(xì)胞膜，因為電荷被磷脂雙層內(nèi)部的疏水尾部排斥。 為了促進(jìn)滲透性，鈣黃綠素標(biāo)記有幾個乙酰氧基甲基酯基團(tuán)，例如鈣黃綠素 AM，從而形成不帶電的疏水化合物。 這種疏水性的增加使鈣黃綠素 AM 能夠自由擴(kuò)散穿過完整的質(zhì)膜并滲透到活細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中。

問：如何制作鈣黃綠素溶液？

答：鈣黃綠素及其衍生物鈣黃綠素 AM 通常以凍干固體形式提供，在裝入細(xì)胞之前必須重新懸浮在溶液（通常是 DMSO）中。 要制作鈣黃綠素或鈣黃綠素 AM 庫存溶液，請在高質(zhì)量無水 DMSO 中重組染料，使?jié)舛燃s為 1 mg/mL。 例如，將 50 µL DMSO 添加到 50 µg 鈣黃綠素 AM 中將產(chǎn)生 1 mg/mL 庫存溶液。

對于鈣黃綠素 AM，在加載到細(xì)胞中之前，需要將庫存溶液進(jìn)一步稀釋到水性緩沖液（例如 HBSS）中。 作為水溶液，鈣黃綠素 AM 易水解，應(yīng)在一天內(nèi)使用。圖為儲備溶液的配制方案，供參考。

問：鈣黃綠素AM陽性對照和陰性對照是什么？

答：陽性對照：這是在正常培養(yǎng)環(huán)境中生長的健康、未經(jīng)處理的細(xì)胞群。 未經(jīng)處理的健康細(xì)胞既含有胞內(nèi)酯酶將鈣黃綠素 AM 水解成熒光產(chǎn)物，又含有完整的質(zhì)膜以保留染料。 用鈣黃綠素 AM 染色陽性對照會導(dǎo)致細(xì)胞在藍(lán)光下激發(fā)時發(fā)出綠色熒光。

陰性對照：這是一群死細(xì)胞，通常用乙醇或甲醛固定。 死細(xì)胞不含細(xì)胞內(nèi)酯酶，因此不能將非熒光鈣黃綠素 AM 底物轉(zhuǎn)化為熒光鈣黃綠素產(chǎn)物。 用鈣黃綠素 AM 染色的陰性對照不會產(chǎn)生熒光信號。

在進(jìn)行鈣黃綠素 AM 細(xì)胞活力檢測以對比結(jié)果的變化時，與目標(biāo)樣本一起進(jìn)行適當(dāng)?shù)年栃院完幮詫φ辗浅Ｖ匾?所有對照都應(yīng)從與目標(biāo)樣本相同的培養(yǎng)物中獲得。

問：AM（乙酰氧基甲基）基團(tuán)對鈣黃綠素的作用是什么？

答：鈣黃綠素AM中的AM酯具有兩個關(guān)鍵功能。首先，AM酯與鈣黃綠素連接時，會將鈣黃綠素帶負(fù)電的羧基轉(zhuǎn)化為不帶電荷的疏水化合物。這通過使鈣黃綠素AM能夠自由地穿過質(zhì)膜并滲透胞質(zhì)溶膠來促進(jìn)細(xì)胞滲透。其次，鈣黃綠素染料，雖然是AM酯形式，但是非熒光的。一旦細(xì)胞滲透到胞質(zhì)溶膠中，非特異性細(xì)胞內(nèi)酯酶切割出AM基團(tuán)，熒光就會恢復(fù)。此外，AM酯的水解恢復(fù)了鈣黃綠素的負(fù)電荷，這時染料才可以被熒光儀器所檢測。

問：鈣黃綠素AM能染色死細(xì)胞或壞死的細(xì)胞嗎？

答：不，鈣黃綠素 AM 不會染色死細(xì)胞或壞死細(xì)胞，因為它們?nèi)狈⒎菬晒忖}黃綠素 AM 轉(zhuǎn)化為熒光鈣黃綠素所必需的酶（例如，非特異性細(xì)胞內(nèi)酯酶）。 由于未被細(xì)胞內(nèi)酯酶切割的鈣黃綠素 AM 底物是非熒光的，因此成像前不需要洗滌步驟。圖示：在 Costar 黑色/透明底 96 孔板中用 Calcein UltraBlue AM（貨號 21908）染色的 HeLa 細(xì)胞的熒光圖像。 左圖：HH 緩沖液中的活 HeLa 細(xì)胞； 右圖：用冰冷甲醇固定的死細(xì)胞/壞死細(xì)胞。