【產(chǎn)品用途】本產(chǎn)品可應(yīng)用于核酸RNA的快速擴(kuò)增。

【檢測(cè)原理】本產(chǎn)品是基于重組酶介導(dǎo)鏈置換核酸擴(kuò)增（Recombinase-aid Amplification，RAA）技術(shù)開發(fā)的恒溫核酸擴(kuò)增檢測(cè)試劑，在42℃恒溫條件下特異識(shí)別并擴(kuò)增目標(biāo)樣本的RNA片段，可用Genchek 熒光檢測(cè)儀實(shí)時(shí)監(jiān)控?cái)U(kuò)增過程，5-20 min 即可完成擴(kuò)增檢測(cè)。

【技術(shù)原理】重組酶介導(dǎo)鏈置換核酸擴(kuò)增（Recombinase-aid Amplification，RAA），是一種恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)。 RT-RAA先利用逆轉(zhuǎn)錄酶將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，從細(xì)菌或真菌中獲得的重組酶在常溫下可與引物DNA緊密結(jié)合，形成重組酶/引物復(fù)合體，侵入RNA-cDNA雙鏈核酸模板，在侵入位點(diǎn)重組酶將雙鏈打開，同時(shí)單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合到被重組酶打開的單鏈上，維持雙鏈模板處于開鏈狀態(tài)。重組酶/引物復(fù)合體開始對(duì)雙鏈進(jìn)行掃描，當(dāng)引物在模板上搜索到與之WANQUAN匹配的互補(bǔ)序列時(shí)，重組酶/引物復(fù)合體解體，DNA聚合酶結(jié)合到引物的3’端，開始合成新鏈。成的新鏈又可 以作為模板，最終擴(kuò)增產(chǎn)物以指數(shù)級(jí)增長，完成靶標(biāo)基因的擴(kuò)增。經(jīng)過熒光標(biāo)記的探針與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，當(dāng)探針被核酸外切酶酶切后發(fā)出熒光信號(hào)，可對(duì)擴(kuò)增過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。本試劑盒具有快速、靈敏度高以及特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，反應(yīng)組分已混合并冷凍干燥成反應(yīng)干粉，操作簡便，易于保存。

【引物設(shè)計(jì)與探針設(shè)計(jì)】

引物設(shè)計(jì)建議方法：RAA核酸擴(kuò)增技術(shù)對(duì)引物設(shè)計(jì)的要求與常規(guī)PCR引物設(shè)計(jì)有一定的區(qū)別。由兩條寡核苷酸組成一對(duì)引物，分別特異性識(shí)別一個(gè)核酸目標(biāo)物的上下游核苷酸序列；引物長度在30-35nt之間，序列中無回文序列、連續(xù)單堿基重復(fù)序列和內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)；引物Tm值不作為設(shè)計(jì)時(shí)主要考慮因素；引物對(duì)需通過試驗(yàn)優(yōu)化篩選得到，要求其擴(kuò)增產(chǎn)物為單一條帶，無非特異性擴(kuò)增和明顯的引物二聚體。

探針設(shè)計(jì)建議方法：探針序列不與引物識(shí)別位點(diǎn)重疊，長度在46-52 nt之間，序列避免回文序列、內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)和連續(xù)的重復(fù)堿基；共有四個(gè)修飾位點(diǎn)，距離 5’端的≥35 nt的中部位置標(biāo)記一個(gè) dSpacer（四氫呋喃，THF），作為核酸外切酶的識(shí)別位點(diǎn)；THF 位點(diǎn)的上游標(biāo)記一個(gè)熒光基團(tuán)，下游標(biāo)記一個(gè)淬滅基團(tuán)，兩個(gè)基團(tuán)的間距為 2-4 nt，THF 距離3’末端≥15nt；在3’末端標(biāo)記一個(gè)修飾基團(tuán)，例如胺基、磷酸基團(tuán)、shengwusu、shengwusu-TEG 或 C3-spacer。

建議：在開展 RT-RAA （熒光型）擴(kuò)增反應(yīng)之前，行引物的篩選試驗(yàn)， 以便得到較高的檢測(cè)靈敏度