內(nèi)pH的變化與多種生理和病理過程有關(guān)，包括細(xì)胞增殖，凋亡，受精，惡性腫瘤，多藥耐藥性，離子轉(zhuǎn)運，溶酶體貯積病和阿爾茨海默氏病。Cell Meter™熒光細(xì)胞內(nèi)pH值測定試劑盒利用AAT Bioquest專有的熒光指示劑來測量相對細(xì)胞內(nèi)pH值變化。這是一種均質(zhì)，動力學(xué)，活細(xì)胞熒光測定法，采用標(biāo)準(zhǔn)程序或酸加載程序。該標(biāo)準(zhǔn)方案設(shè)計用于在治療后隨著細(xì)胞內(nèi)pH的降低來測量目標(biāo)治療靶標(biāo)?！八嶝?fù)荷" 該程序旨在測量由于GPCR激活或生長因子活性而引起的細(xì)胞代謝與細(xì)胞代謝變化相關(guān)的pH值升高。通過“酸性加載"程序，將熒光pH染料以zui小體積加載到細(xì)胞中后，添加氯化銨溶液。此“加酸"步驟之后，在相對較大體積的緩沖液（?4X）中添加激動劑。突然的體積變化引發(fā)細(xì)胞中氨（NH3）的流出，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)pH值迅速降低，從而導(dǎo)致熒光信號降低。激動劑對隨后細(xì)胞內(nèi)pH恢復(fù)的作用通過相對熒光信號增加來測量。在將熒光pH染料以zui小體積加載到細(xì)胞中后，添加氯化銨溶液。此“加酸"步驟之后，在相對較大體積的緩沖液（?4X）中添加激動劑。突然的體積變化引發(fā)細(xì)胞中氨（NH3）的流出，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)pH值迅速降低，從而導(dǎo)致熒光信號降低。激動劑對隨后細(xì)胞內(nèi)pH恢復(fù)的作用通過相對熒光信號增加來測量。在將熒光pH染料以zui小體積加載到細(xì)胞中后，添加氯化銨溶液。此“加酸"步驟之后，在相對較大體積的緩沖液（?4X）中添加激動劑。突然的體積變化引發(fā)細(xì)胞中氨（NH3）的流出，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)pH值迅速降低，從而導(dǎo)致熒光信號降低。激動劑對隨后細(xì)胞內(nèi)pH恢復(fù)的作用通過相對熒光信號增加來測量。

平臺

組件

標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞負(fù)荷的協(xié)議摘要（一個板）

1. 在生長培養(yǎng)基中準(zhǔn)備細(xì)胞

2. 加入等體積的RatioWorks™BCFL，AM染料加工溶液

3. 在37°C孵育1小時

4. 加入50 µL /孔化合物（或505/535 nm和430/535 nm的比率），在Ex / Em = 490/535 nm（截止= 515 nm）下讀取熒光。

載酸方案摘要（一個96孔板）

1. 在生長培養(yǎng)基中準(zhǔn)備細(xì)胞

2. 除去生長培養(yǎng)基

3. 添加RatioWorks™BCFL，AM染料工作液（50 µL /孔/ 96孔板）

4. 在37°C孵育1小時

5. 添加220 mM NH ₄ Cl（5 µL /孔）

6. 在室溫孵育15分鐘

7. 加入200 µL /孔化合物（或505/535 nm和430/535 nm的比率），在Ex / Em = 490/535 nm（截止= 515 nm）下讀取熒光。

重要說明
開始實驗之前，請在室溫下解凍所有試劑盒組件。

除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。

1. RatioWorks™BCFL，AM儲備溶液：
將200 µL DMSO加入小瓶的Ratioatio™BCFL，AM（組分A）中，并充分混合以制成RatioWorks™BCFL，AM儲備溶液。注意：20 µL的重組過的RatioWorks™BCFL，AM儲備溶液足以用于一盤標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞上樣。10 µL的重組過的RatioWorks™BCFL，AM儲備溶液足以容納1盤酸負(fù)載。如果將管密封，RatioWorks™BCFL，AM儲備溶液可以在≤-20  ^o C下保存一個月。避光。

準(zhǔn)備工作溶液

對于標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞上樣（一塊板）

1.將1 mL的10X Pluronic F127 Plus（組分B）添加到9 mL的HHBS（組分C）中，并充分混合以制成1X分析緩沖液。注意：  對于需要binghuangshu進(jìn)行加載的細(xì)胞（例如CHO細(xì)胞），請以1至5 mM的濃度稀釋50 mM ReadiUse™binghuangshu（組分D）（對于CHO細(xì)胞，優(yōu)選5 mM）。

2.將20 µL重構(gòu)的RatioWorks™BCFL，AM儲備溶液添加到10 mL的1X分析緩沖液中，并充分混合以制成RatioWorks™BCFL，AM染料工作溶液。該RatioWorks™BCFL，AM染料加工溶液在室溫下至少可穩(wěn)定2小時。

對于酸性負(fù)載（一個96孔板）

1.將1 mL的10X Pluronic F127 Plus（組分B）添加到4 mL的HHBS（組分C）中，并充分混合以制成1X分析緩沖液。注意： 對于需要binghuangshu進(jìn)行加載的細(xì)胞（例如CHO細(xì)胞），請以0.5至2.5 mM的濃度稀釋50 mM ReadiUse™binghuangshu（成分D）（對于CHO細(xì)胞，優(yōu)選2.5 mM）。

2.將10 µL重構(gòu)的RatioWorks™BCFL，AM儲備溶液添加到5 mL的1X分析緩沖液中，并充分混合以制成RatioWorks™BCFL，AM染料工作溶液。該RatioWorks™BCFL，AM染料加工溶液在室溫下至少可穩(wěn)定2小時。

程序

針對標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞負(fù)載進(jìn)行pH測定

1. 將100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的RatioWorks™BCFL，AM染料工作液添加到細(xì)胞板中。注意：如果您的化合物干擾血清，則必須用HHBS緩沖液（對于96孔板為100 µL /孔，對于384孔板為25 µL /孔）替換生長培養(yǎng)基，這一點很重要。
   

2. 將染料加載板在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，然后在室溫下再孵育30分鐘。注意：如果測定需要37°C，請立即進(jìn)行實驗，而無需進(jìn)一步室溫孵育。
   

3. 通過使用HHBS或所需的緩沖液來準(zhǔn)備復(fù)合板。
   

4. 通過監(jiān)控Ex / Em = 490/535 nm（截止= 515 nm）或505/535 nm和430/535 nm（截止= 515 nm）的熒光來進(jìn)行pH分析，以進(jìn)行比率測量?；衔锾砑恿繛?0 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）。注意：測定應(yīng)在添加化合物后3至5分鐘內(nèi)完成，但是建議在測定開發(fā)期間至少收集8分鐘的數(shù)據(jù)。
   

運行pH值測定酸負(fù)荷

1. 從細(xì)胞板中去除生長培養(yǎng)基。
   

2. 將50 µL /孔/ 96孔板Ratioatio™BCFL，AM染料加工溶液添加到細(xì)胞板中。
   

3. 將染料加載板在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，然后在室溫下再孵育30分鐘。注意：如果測定需要37°C，請立即進(jìn)行實驗，而無需進(jìn)一步室溫孵育。
   

4. 加入5 µL 220 mM NH ₄ Cl并將板離心5秒。在室溫下孵育15分鐘。注意： NH ₄ Cl溶液應(yīng)在HHBS（組分C）中新鮮配制。
   

5. 通過使用HHBS或所需的緩沖液來準(zhǔn)備復(fù)合板。
   

6. 通過監(jiān)控Ex / Em = 490/535 nm（截止= 515 nm）或505/535 nm和430/535 nm（截止= 515 nm）的熒光來進(jìn)行pH分析，以進(jìn)行比率測量?；衔锾砑恿繛?00 µL /孔/ 96孔板。注意：測定應(yīng)在添加化合物后3至5分鐘內(nèi)完成，但是建議在測定開發(fā)期間至少收集8分鐘的數(shù)據(jù)。

數(shù)據(jù)分析