氫乙啶可有效地用作測量活性氧的探針。染料自由進入細胞并脫氫成乙錠化合物。該探針已廣泛用于NK細胞，并作為重要的染料用于鑒定腫瘤中的增殖和低氧細胞。已經(jīng)使用嗜中性粒細胞和內(nèi)皮細胞以及HL60細胞和巨噬細胞進行了研究。該探針的主要優(yōu)點是其能夠區(qū)分超氧化物和過氧化氫。熒光發(fā)射發(fā)生在大約600 nm處。

平臺

儲備溶液的制備

除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。

氫乙啶[二氫乙啶]儲備溶液：
5-10 mM DMSO儲備溶液。注意：未使用的DMSO儲備溶液應(yīng)分裝到一次性小瓶中，并儲存在-20°C下。遠離光。

準備工作溶液

氫乙二胺[Dihydroethidium]染料工作溶液：
在生理緩沖液（如PBS，HBSS，HEPES）中使染料工作濃度為5 – 20 µM。注意：必須憑經(jīng)驗確定*的應(yīng)用工作濃度。

程序

1. 向細胞中加入等體積的染料工作溶液（例如，生長培養(yǎng)基中的細胞為100 µL），并在室溫或37°C下孵育細胞5至60分鐘。
    
2. 在將細胞暴露于實驗誘導(dǎo)之前，確定負載細胞樣品的基線熒光強度。
    
3. 陰性對照應(yīng)評估如下：
    
   1. 檢查有無誘導(dǎo)劑的染料和緩沖液/培養(yǎng)基的無細胞混合物的熒光。在不存在細胞外酯酶和其他氧化酶的情況下，熒光隨時間的逐漸增加可能與自發(fā)水解，大氣氧化和/或光誘導(dǎo)的氧化有關(guān)。
       
   2. 檢查未處理的（對照）已裝載在生長培養(yǎng)基或緩沖液中的細胞的熒光。在健康的細胞中，氧自由基被細胞酶和/或天然抗氧化劑消除。在染料加載恢復(fù)期之后，健康細胞應(yīng)表現(xiàn)出較低水平的熒光，在整個實驗過程中相對穩(wěn)定；然而，可以觀察到熒光的逐漸增加（由于自氧化）或減少（由于染料從細胞損失或光漂白）。在沒有任何刺激或誘導(dǎo)的情況下，未經(jīng)處理的健康細胞中的熒光爆發(fā)可能表明細胞死亡或其他氧化事件的進展。
       
4. 陽性對照可用氫過氧化叔丁基（TBHP）刺激至終濃度?100 µM（根據(jù)細胞的敏感性和反應(yīng)而增加或減少劑量）。

計算器

普通儲備溶液的制備

表1.將一定比例的氫乙啶[二氫乙錠] * CAS 104821-25-2 *重構(gòu)為給定濃度所需的DMSO體積。請注意，該體積僅用于制備儲備溶液。有關(guān)適當?shù)膶嶒?生理緩沖液，請參閱樣本實驗方案。

糖度計算器

輸入任何兩個值（質(zhì)量，體積，濃度）以計算第三個值。