yanxianan腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和yanxianan腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的兩個重要輔助因子。NADH是NAD +的還原形式，而NAD +是NADH的氧化形式。它形成NADP，并通過酯鍵將磷酸基團(tuán)加到腺苷酸核苷酸的2'位置。NADP被用于需要NADPH作為還原劑的合成代謝生物反應(yīng)，例如脂肪酸和核酸合成。在葉綠體中，NADP是一種在光合作用的初步反應(yīng)中很重要的氧化劑。然后將通過光合作用產(chǎn)生的NADPH用作光合作用加爾文循環(huán)中生物合成反應(yīng)的還原能力。傳統(tǒng)的NAD / NADH和NADP / NADPH分析是通過監(jiān)測340 nm處的NADH或NADPH吸收來完成的。由于該方法在需要昂貴的石英微孔板的紫外線范圍內(nèi)進(jìn)行，因此該方法靈敏度低且干擾大。該Amplite™NAD / NADH分析試劑盒為靈敏檢測NAD和NADH提供了便利的方法。系統(tǒng)中的酶在酶循環(huán)反應(yīng)中特異性識別NAD / NADH。無需從樣品混合物中純化NAD / NADH。酶循環(huán)反應(yīng)顯著提高了檢測靈敏度。另外，該測定法具有非常低的背景，因?yàn)樗诩t色可見范圍內(nèi)運(yùn)行，可顯著降低來自生物樣品的干擾。該測定法證明了在570 nm激發(fā)590 nm發(fā)射下具有高靈敏度和低干擾。該Amplite™NAD / NADH分析試劑盒為靈敏檢測NAD和NADH提供了便利的方法。系統(tǒng)中的酶在酶循環(huán)反應(yīng)中特異性識別NAD / NADH。無需從樣品混合物中純化NAD / NADH。酶循環(huán)反應(yīng)顯著提高了檢測靈敏度。另外，該測定法具有非常低的背景，因?yàn)樗诩t色可見范圍內(nèi)運(yùn)行，可顯著降低來自生物樣品的干擾。該測定法證明了在570 nm激發(fā)590 nm發(fā)射下具有高靈敏度和低干擾。該Amplite™NAD / NADH分析試劑盒為靈敏檢測NAD和NADH提供了便利的方法。系統(tǒng)中的酶在酶循環(huán)反應(yīng)中特異性識別NAD / NADH。無需從樣品混合物中純化NAD / NADH。酶循環(huán)反應(yīng)顯著提高了檢測靈敏度。另外，該測定法具有非常低的背景，因?yàn)樗诩t色可見范圍內(nèi)運(yùn)行，可顯著降低來自生物樣品的干擾。該測定法證明了在570 nm激發(fā)590 nm發(fā)射下具有高靈敏度和低干擾。酶循環(huán)反應(yīng)顯著提高了檢測靈敏度。另外，該測定法具有非常低的背景，因?yàn)樗诩t色可見范圍內(nèi)運(yùn)行，可顯著降低來自生物樣品的干擾。該測定法證明了在570 nm激發(fā)590 nm發(fā)射下具有高靈敏度和低干擾。酶循環(huán)反應(yīng)顯著提高了檢測靈敏度。另外，該測定法具有非常低的背景，因?yàn)樗诩t色可見范圍內(nèi)運(yùn)行，可顯著降低來自生物樣品的干擾。該測定法證明了在570 nm激發(fā)590 nm發(fā)射下具有高靈敏度和低干擾。

1. 準(zhǔn)備NADH標(biāo)準(zhǔn)品或測試樣品（50 µL）

2. 加入NAD / NADH工作溶液（50 µL）

3. 在室溫下孵育15分鐘-2小時

4. 監(jiān)測Ex / Em = 540/590 nm（截止= 570 nm）的熒光強(qiáng)度

重要說明
開始實(shí)驗(yàn)之前，請在室溫下解凍每種試劑盒成分之一。

除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。

1. NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mM）：
將200 µL 1X PBS緩沖液加到NADH Standard（組分C）小瓶中，制成1 mM（1 nmol / µL）NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液。

配制標(biāo)準(zhǔn)溶液

為了方便起見，請使用我們的系列稀釋計

向990 µL 1X PBS緩沖液中加入10 µL 1 mM（1 nmol / µL）NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液，以生成10 µM（10 pmol / µL）NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液（NS7）。取10 µM NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液（NS7）在1X PBS緩沖液中進(jìn)行1：3系列稀釋，以得到系列稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)液（NS6- NS1）。注意：稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定，應(yīng)在4小時內(nèi)使用。

準(zhǔn)備工作溶液

將10 mL的NADH傳感器緩沖液（組分B）添加到NAD / NADH循環(huán)酶混合物（組分A）的瓶子中，并充分混合以制成NAD / NADH工作溶液。 注意：此NAD / NADH工作溶液足以用于兩個96孔板。

程序

表1。黑色固體底部96孔微孔板中NADH標(biāo)準(zhǔn)品和測試樣品的布局。NS = NADH標(biāo)準(zhǔn)品（NS1-NS7，0.014至10 µM），BL =空白對照，TS =測試樣品。

表2.  每個孔的試劑組成。高濃度的NADH（例如，> 100 µM，zui終濃度）可能會由于NADH傳感器過度氧化（變成非熒光產(chǎn)物）而導(dǎo)致熒光信號降低。

1. 根據(jù)表1和表2提供的布局，準(zhǔn)備NADH標(biāo)準(zhǔn)液（NS），空白對照（BL）和測試樣品（TS）。對于384孔板，每孔使用25 µL試劑，而不是50 µL。 注意：根據(jù)需要準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣品。
   

2. 將50 µL NAD / NADH工作溶液添加到NADH標(biāo)準(zhǔn)品，空白對照和測試樣品的每個孔中，使總NAD / NADH測定體積為100 µL /孔。對于384孔板，將25 µL NAD / NADH工作溶液添加到每個孔中，總體積為50 µL /孔。
   

3. 在避光的條件下，將反應(yīng)在室溫下孵育15分鐘至2小時。
   

4. 使用熒光板讀數(shù)器在Ex / Em = 540/590 nm（截止= 570 nm）處監(jiān)控?zé)晒獾脑黾印?em>注意：該板的內(nèi)容物也可以轉(zhuǎn)移到白色的透明底板上，并通過吸光度酶標(biāo)儀在576±5 nm的波長下讀取。與熒光讀數(shù)相比，吸收檢測的靈敏度較低。注意：  對于NAD / NADH比測量，建議使用套件15263。注意：  對于基于細(xì)胞的NAD / NADH測量，建議使用ReadiUse™哺乳動物細(xì)胞裂解緩沖液* 5X *（目錄號20012）來裂解細(xì)胞。

數(shù)據(jù)分析

2e+42e+41e+46.0e+32.4e+31.8e+31.2e+3600- NADPH- NADHData legendGenerated with Quest Graph™NADH or NADPH (uM)RFUX: 2.73e+3Hover mouse to interactY: 2.1e+4Y: 2.1e+4Y: 273.09Y: 273.09

從空白標(biāo)準(zhǔn)孔獲得的讀數(shù)（RFU）用作陰性對照。從其他標(biāo)準(zhǔn)的讀數(shù)中減去該值即可得到基線校正值。然后，繪制標(biāo)準(zhǔn)讀數(shù)，以獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線和方程式。該方程式可用于計算NADH或NADPH樣品

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