監(jiān)測(cè)各種蛋白酶活性已成為許多生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)任務(wù)。我們的Amplite™通用熒光蛋白酶活性測(cè)定試劑盒是進(jìn)行蛋白酶分離過(guò)程中必需的常規(guī)測(cè)定或鑒定蛋白質(zhì)樣品中污染性蛋白酶的理想選擇。該試劑盒使用熒光酪蛋白結(jié)合物，已證明是廣泛蛋白酶的通用底物。在完整的底物中，酪蛋白被熒光染料大量標(biāo)記，導(dǎo)致明顯的熒光猝滅。蛋白酶催化的水解減輕了其猝滅作用，產(chǎn)生了明亮的熒光染料標(biāo)記的短肽。熒光強(qiáng)度的增加與蛋白酶活性成正比。

測(cè)量測(cè)試樣品中的蛋白酶活性（協(xié)議A）

1. 準(zhǔn)備蛋白酶底物溶液（50 µL）

2. 加入底物對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照或測(cè)試樣品（50 µL）

3. 跳過(guò)孵育以獲取動(dòng)力學(xué)讀數(shù)，或孵育30至60分鐘以獲取終點(diǎn)讀數(shù)

4. 監(jiān)測(cè)Ex / Em = 490/525 nm的熒光強(qiáng)度

使用純化的酶（協(xié)議B）篩選蛋白酶抑制劑

1. 準(zhǔn)備蛋白酶底物溶液（10 µL）

2. 添加底物對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照，載體對(duì)照或測(cè)試樣品（90 µL）

3. 跳過(guò)孵育以獲取動(dòng)力學(xué)讀數(shù)，或孵育30至60分鐘以獲取終點(diǎn)讀數(shù)

4. 監(jiān)測(cè)Ex / Em = 490/525 nm的熒光強(qiáng)度

重要      開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前，請(qǐng)?jiān)谑覝叵陆鈨鏊性噭┖薪M件。請(qǐng)根據(jù)需要選擇協(xié)議A或協(xié)議B。

準(zhǔn)備工作解決方案

1.蛋白酶底物溶液（針對(duì)方案A）

在2X分析緩沖液（組分C）中以1：100稀釋蛋白酶底物（組分A）。在96孔板中每次測(cè)定使用50 µL蛋白酶底物溶液。
注意       2X分析緩沖液（組分C）設(shè)計(jì)用于檢測(cè)yiningrudanbaimei，yidanbaimei，嗜熱菌蛋白酶，蛋白酶K，蛋白酶XIV和人白細(xì)胞彈性蛋白酶的活性。對(duì)于其他蛋白酶，請(qǐng)參考下表1中的適當(dāng)測(cè)定緩沖液配方。

2.yidanbaimei稀釋（針對(duì)方案A）

在去離子水中以1:50的比例稀釋yidanbaimei（5 U / µL，組分B）以達(dá)到0.1 U / µL的濃度。

3.分析緩沖液（1X）（用于方案B）

將5 mL去離子水加到5 mL 2X分析緩沖液（組分C）中。

4.蛋白酶底物溶液（針對(duì)方案B）

在1X分析緩沖液中以1:20的比例稀釋蛋白酶底物（組分A）。對(duì)于96孔板，使用10 µL /孔的蛋白酶底物溶液。
注意       2X分析緩沖液（組分C）設(shè)計(jì)用于檢測(cè)yiningrudanbaimei，yidanbaimei，嗜熱菌蛋白酶，蛋白酶K，蛋白酶XIV和人白細(xì)胞彈性蛋白酶的活性。對(duì)于其他蛋白酶，請(qǐng)參考下表1中的適當(dāng)測(cè)定緩沖液配方。

5.蛋白酶稀釋（針對(duì)方案B）

在1X分析緩沖液中將蛋白酶稀釋至500-1000 nM的濃度（對(duì)于yidanbaimei50-100 U / mL）。每個(gè)孔需要稀釋10 µL的蛋白酶。為所有測(cè)試樣品準(zhǔn)備適當(dāng)?shù)牧?，并為?yáng)性對(duì)照和媒介物對(duì)照孔準(zhǔn)備額外的量。
表1. 蛋白酶的測(cè)定緩沖液配方。對(duì)于方案A，需要2X分析緩沖液。對(duì)于方案B，需要1X檢測(cè)緩沖液。

樣品實(shí)驗(yàn)方案

方案A：測(cè)量測(cè)試樣品中的蛋白酶活性

表1. 96孔微孔板中底物對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照和測(cè)試樣品的布局。SC =底物對(duì)照，PC =陽(yáng)性對(duì)照，TS =測(cè)試樣品。

表2. 每個(gè)孔的試劑組成。如果使用的蛋白酶樣品少于50 µL，則添加ddH ₂ O，使總體積為50 µL。

1. 將50 µL蛋白酶底物溶液（方案A）添加到測(cè)定板中的所有孔中。充分混合試劑。

2. 使用熒光板讀數(shù)器在Ex / Em = 490/525 nm處監(jiān)測(cè)熒光的增加。 對(duì)于動(dòng)力學(xué)讀數(shù)：立即開(kāi)始連續(xù)連續(xù)測(cè)量熒光強(qiáng)度，并每5分鐘記錄一次數(shù)據(jù)，持續(xù)30分鐘。 對(duì)于終點(diǎn)讀數(shù)：在避光的條件下，將反應(yīng)在所需溫度下孵育30至60分鐘。然后測(cè)量熒光強(qiáng)度。

方案B：使用純化的酶篩選蛋白酶抑制劑

表3. 96孔微孔板中樣品的布局。SC =底物對(duì)照，PC =陽(yáng)性對(duì)照，VC =載體對(duì)照，TS =測(cè)試樣品。建議每種測(cè)試化合物至少測(cè)試三種不同濃度。所有測(cè)試樣品應(yīng)一式兩份或一式三份進(jìn)行。

表4. 每個(gè)孔的試劑組成。對(duì)于加入孔中的每種體積的測(cè)試化合物，需要檢查用于遞送測(cè)試化合物的相同體積的溶劑，以檢查媒介物對(duì)蛋白酶活性的影響。

1. 將10 µL蛋白酶底物溶液（方案B）添加到陽(yáng)性對(duì)照（PC），溶媒對(duì)照（VC）和測(cè)試樣品（TS）的孔中。充分混合試劑。

2. 使用熒光板讀數(shù)器在Ex / Em = 490/525 nm處監(jiān)控?zé)晒鈴?qiáng)度。 對(duì)于動(dòng)力學(xué)讀數(shù)：立即開(kāi)始連續(xù)連續(xù)測(cè)量熒光強(qiáng)度，并每5分鐘記錄一次數(shù)據(jù)，持續(xù)30分鐘。 對(duì)于終點(diǎn)讀數(shù)：在避光的條件下，將反應(yīng)在所需溫度下孵育30至60分鐘。然后測(cè)量熒光強(qiáng)度。

示例數(shù)據(jù)分析和圖形

底物對(duì)照孔中的熒光用作對(duì)照，并通過(guò)酶促反應(yīng)從其他孔的值中減去。
將每個(gè)樣品的相對(duì)熒光單位（RFU）與時(shí)間作圖（如圖1所示）。
確定反應(yīng)為線性的初始時(shí)間點(diǎn)的范圍。10-15％的轉(zhuǎn)化率似乎是*范圍。
獲得以RFU / min 為單位的初始反應(yīng)速度（V ₀）。確定數(shù)據(jù)圖的線性部分的斜率。
可以進(jìn)行多種數(shù)據(jù)分析，例如確定抑制百分比，IC ₅₀，K _m，K _i等。

圖1.用Amplite™通用熒光蛋白酶活性測(cè)定試劑盒分析yidanbaimei的活性。蛋白酶底物在試劑盒測(cè)定緩沖液中與1單位yidanbaimei孵育。對(duì)照孔僅具有蛋白酶底物（沒(méi)有yidanbaimei）。從添加yidanbaimei的時(shí)間0開(kāi)始測(cè)量熒光信號(hào)。樣品一式三份。