過氧化氫（H2O2）是一種活性氧代謝副產物，可作為許多氧化應激相關狀態(tài)的關鍵調節(jié)劑。它涉及許多與哮喘，動脈粥樣硬化，糖尿病性血管病變，骨質疏松癥，許多神經退行性疾病和唐氏綜合癥有關的生物學事件。過氧化氫生物學有趣的方面也許是zui近的報道，即抗體具有將分子氧轉化為過氧化氫的能力，有助于免疫系統(tǒng)的正常識別和破壞過程。對這種反應性物種的測量將有助于確定氧化應激如何調節(jié)各種細胞內途徑。該Cell Meter™過氧化氫檢測試劑盒使用我們*的OxiVision™Green過氧化氫傳感器對活細胞中的過氧化氫進行定量。OxiVision™Green具有細胞滲透性，當它與過氧化氫反應時會發(fā)出綠色熒光。該套件是一種優(yōu)化的“混合與讀取”化驗格式，與HTS液體處理儀器兼容。

1. 準備并添加Amplite™綠色過氧化物傳感器工作溶液（50 µL）
2. 加入H ₂ O ₂標準品或測試樣品（50 µL）
3. 在室溫下孵育15-60分鐘
4. 在Ex / Em = 490/525 nm（截止= 515 nm）時讀取熒光強度

重要說明
開始實驗之前，請在室溫下解凍所有試劑盒組件。

活細胞分析的方案摘要

1. 在生長培養(yǎng)基中準備細胞
2. 用Amplite™綠色過氧化物傳感器工作溶液對細胞染色，并孵育所需的時間
3. 用測試化合物處理細胞
4. 使用底部讀取模式監(jiān)控Ex / Em = 490/525 nm（截止= 515 nm）的熒光強度

重要說明
Amplite™綠色過氧化物傳感器可以被動加載到活細胞中，并報告細胞內H ₂ O ₂濃度的微摩爾變化。以下是建議的顯微鏡成像協(xié)議，可以對其進行修改以滿足特定的研究需求。

除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在-20°C下。避免重復凍融循環(huán)。

1. Amplite™綠色過氧化物傳感器原液（250X）：
將50 µL DMSO（組分D）添加到Amplite™綠色過氧化物傳感器（組分A）的小瓶中，制成250X Amplite™綠色過氧化物傳感器原液。避光。

2. H ₂ O ₂標準溶液（20 mM）：
將22.7 µL的3％H ₂ O ₂（0.88 M，組分B）添加到977 µL的測定緩沖液（組分C）中，制成20 mM H ₂ O ₂ 標準溶液。注意：稀釋的H ₂ O ₂  標準溶液不穩(wěn)定。未使用的部分應丟棄。

配制標準溶液

為了方便起見，請使用我們的系列稀釋計

 向950 µL的測定緩沖液（組分C）中加入50 µL的20 mM H ₂ O ₂標準溶液，得到1000 µM H ₂ O _2的  標準溶液。取1000 µM H ₂ O ₂  標準溶液，并進行1：3連續(xù)稀釋，以使用測定緩沖液（組分C）獲得連續(xù)稀釋的H ₂ O ₂標準溶液（HS1- HS7）。

準備工作溶液

將20μL250X Amplite™綠色過氧化物傳感器原液添加到5 mL的測定緩沖液（組分C）中，制成Amplite™綠色過氧化物傳感器工作液。

程序

在上清液反應中運行H ₂ O ₂分析：

表1.黑色96孔微孔板 中H ₂ O ₂標準品和測試樣品的布局。HS = H ₂ O ₂標準品（HS1-HS7，300至0.3 µM）；BL =空白控件；TS =測試樣品

表2.  每個孔的試劑組成。

1. 根據表1和表2提供的布局，準備H ₂ O ₂標準品（HS），空白對照（BL）和測試樣品（TS）。對于384孔板，每孔使用25 µL試劑代替50微升。
    
2. 向H ₂ O ₂標準品，空白對照和測試樣品的每個孔中添加50 µL Amplite™綠色過氧化物傳感器工作溶液，以使總H ₂ O ₂分析體積為100 µL /孔。對于384孔板，向每個孔中添加25 µL Amplite™綠色過氧化物傳感器工作溶液，總體積為50 µL /孔。
    
3. 在避光條件下，于室溫下孵育反應15至30分鐘。
    
4. 使用熒光板讀數器在激發(fā)= 490±10，發(fā)射= 520±10 nm（*Ex / Em = 490/525 nm，截止= 515 nm）下監(jiān)控熒光增加。

在活細胞中進行H ₂ O ₂分析：

1. 根據需要激活單元格。
    
2. 用PBS緩沖液洗滌細胞，將細胞與100 µL /孔的Amplite™Green Peroxide Sensor工作溶液孵育5至60分鐘或所需的時間。對于384孔板，請?zhí)砑?5 µL /孔的Amplite™綠色過氧化物傳感器工作溶液。注意：為了進行動力學測量，可以在添加處理之前對細胞進行染色。
    
3. 使用熒光板讀數器（底部讀取模式）在Ex / Em = 490/525 nm（截止= 515 nm）下監(jiān)視熒光的增加，或使用FITC通道使用熒光顯微鏡對熒光變化進行成像。

   11500	Amplite™ 比色法過氧化氫檢測試劑盒	Amplite™ Colorimetric Hydrogen Peroxide Assay Kit	500 Tests
   11501	Amplite™熒光法過氧化氫檢測試劑盒 *紅色熒光*	Amplite™ Fluorimetric Hydrogen Peroxide Assay Kit *Red Fluorescence*	500 Tests
   11502	Amplite™熒光法過氧化氫檢測試劑盒 *近紅外熒光*	Amplite™ Fluorimetric Hydrogen Peroxide Assay Kit *Near Infrared Fluorescence*	500 Tests
   11503	Amplite™熒光法胞內辣根過氧化物酶檢測試劑盒 *綠色熒光*	Amplite™ Intracellular Fluorimetric Hydrogen Peroxide Assay Kit *Green Fluorescence*	200 Tests
   11504	Cell Meter™細胞內熒光法過氧化氫檢測試劑盒 *藍色熒光*	Cell Meter™ Intracellular Fluorimetric Hydrogen Peroxide Assay Kit *Blue Fluorescence*	100 Tests
   11505	Cell Meter™細胞內熒光法過氧化氫檢測試劑盒 *藍色熒光適用于流式細胞儀*	Cell Meter™ Intracellular Fluorimetric Hydrogen Peroxide Assay Kit *Blue Fluorescence Optimized for Flow Cytometry*	100 Tests
   11506	Cell Meter™細胞內熒光法過氧化氫檢測試劑盒 *綠色熒光適用于流式細胞儀*	Cell Meter™ Intracellular Fluorimetric Hydrogen Peroxide Assay Kit *Green Fluorescence Optimized for Flow Cytometry*	100 Tests