蛋白質(zhì)A / G-瓊脂糖

數(shù)據(jù)表

?產(chǎn)品信息收起

蛋白A / G-瓊脂糖以瓊脂糖偶聯(lián)物的形式提供，用于免疫沉淀或純化。產(chǎn)物以0.5ml瓊脂糖的形式在含0.05％diedan化鈉的1ml PBS緩沖液中提供。蛋白A / G-瓊脂糖預(yù)先用BSA封閉，以減少非特異性免疫球蛋白的結(jié)合。提供了足夠的產(chǎn)品用于25-33個(gè)免疫沉淀反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)的重懸體積為30-40ul。
蛋白A / G是一種基因工程蛋白（分子量約50,500；通過SDS-PAGE的分子量約40,000-45,000），結(jié)合了蛋白A和蛋白G的IgG結(jié)合特征。分泌的蛋白A / G包含四個(gè)Fc結(jié)合蛋白A和蛋白G分別來自蛋白A和蛋白G.

特異性收起

蛋白A / G-瓊脂糖適用于小鼠IgG1，IgG2a，IgG2b和IgG3，大鼠IgG1，IgG2a，IgG2b和IgG2c，兔和山羊多克隆抗體以及人IgG1，IgG2，IgG3和IgG4的免疫沉淀。

倉儲(chǔ)收起

將產(chǎn)品保存在4°C下，自發(fā)貨之日起穩(wěn)定一年。

免疫沉淀程序收起

1.在培養(yǎng)皿或燒瓶中，用冰冷的PBS洗滌粘附細(xì)胞兩次，然后瀝干PBS。用PBS洗滌非貼壁細(xì)胞，并在臺(tái)式離心機(jī)中以800至1000 rpm離心5分鐘以沉淀細(xì)胞。

2.向細(xì)胞中加入冰冷的改良RIPA緩沖液（每10 ^7個(gè)細(xì)胞/ 100 mL 皿/ 150 cm ²燒瓶1 mL ；每5 x 10 ^6個(gè)細(xì)胞/ 60 mm皿/ 75 cm ²燒瓶0.5 mL ）

3.用塑料刮板將粘附細(xì)胞從培養(yǎng)皿或燒瓶上刮下。將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到離心管中，并通過21號(hào)針頭進(jìn)行10-20次。

4.在預(yù)冷的離心機(jī)中將裂解液以14,000 xg的速度離心15分鐘。立即將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中并棄去沉淀。

5.要制備蛋白A / G-瓊脂糖，請(qǐng)用PBS洗滌磁珠兩次，然后用PBS還原至50％的漿液。建議在操作瓊脂糖珠時(shí)切掉移液器的jian端，以免破壞珠。

加入20 6預(yù)澄清細(xì)胞裂解物μ 蛋白A / G瓊脂糖漿（50％）每1mL細(xì)胞裂解物的升，并在4孵育℃ 用于在旋轉(zhuǎn)器上10分鐘。當(dāng)稍后將其用于測定時(shí)，預(yù)先清除裂解物將減少蛋白質(zhì)與瓊脂糖的非特異性結(jié)合。

7.通過在40 ℃下以14,000 x 9離心5分鐘除去蛋白A / G-瓊脂糖。將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。

8.確定細(xì)胞裂解液的蛋白質(zhì)濃度（例如，如果進(jìn)行Bradford分析，則必須在確定蛋白質(zhì)濃度之前將細(xì)胞裂解液至少稀釋1:10，因?yàn)榱呀庖褐械娜ノ蹌?huì)干擾考馬斯試劑的作用）。

9.稀釋細(xì)胞裂解物至約1 μ 克/ μ 升總細(xì)胞用PBS蛋白以降低在緩沖器中的去污劑的濃度。更濃縮的細(xì)胞裂解物（IE10 μ 克/ μ 升）可能是必要的免疫沉淀，其在細(xì)胞模型低水平發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)。

10.添加免疫沉淀抗體的推薦量（詳細(xì)信息請(qǐng)見抗體數(shù)據(jù)表）500 μ 升（ie500 μ 細(xì)胞裂解物的克）。

11. 在旋轉(zhuǎn)器上于40 ℃ 輕輕旋轉(zhuǎn)細(xì)胞裂解液/抗體混合物2小時(shí)或過夜。

12.捕獲免疫復(fù)合物通過加入30-40 μ 升蛋白A / G瓊脂糖漿（15-20 μ 升填充珠），并在4在旋轉(zhuǎn)器上輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)1或2小時(shí)℃ 。

13.通過以1000 rpm離心3分鐘收集瓊脂糖珠。棄上清，用800洗珠3次μ 升冰冷的RIPA緩沖液（更嚴(yán)格）或PBS（較不嚴(yán)格）。

14.重懸于30-60的瓊脂糖珠μ 升1X SDS上樣緩沖液，輕輕混勻。

15.將瓊脂糖珠在100 ℃ 煮沸10分鐘，以使免疫復(fù)合物從珠上解離。通過離心收集珠子，并用上清液進(jìn)行SDS-PAGE。

未使用的樣品可存放在-20℃ 供以后使用。