產(chǎn)品信息

產(chǎn)品簡介

  是一種細胞滲透型的X-rosamine衍生物，包含標記線粒體的弱巰基反應(yīng)性的氯甲基官能團。本品是一種氧化型的紅色熒光染料（Ex=579 nm，Em=599 nm），只需簡單孵育細胞，即可被動運輸穿過細胞膜并直接聚集在活性線粒體上。一旦線粒體被染色后，還能根據(jù)后續(xù)實驗的需求進行固定（醛類固定劑如甲醛）和透化（醛類去污劑如Triton X-100），探針依然維持在細胞內(nèi)。本品適合雙標實驗，因其紅色熒光與其他的綠色熒光探針具有良好的分辨率。

雖然傳統(tǒng)的線粒體熒光探針如TMR和羅丹明123，也能很容易的聚集在功能線粒體上，但是一旦線粒體膜電位喪失即會被洗掉，從而在一些需要細胞進行醛類固定或者包含線粒體能量狀態(tài)影響因子的實驗中，使其應(yīng)用大受限制。

步驟說明

1儲存液的配制

本品是以粉末形式提供，使用前需將本品回溫至室溫。

之后使用細胞培養(yǎng)級別的無水DMSO將其充分溶解至終濃度1 mM。

本品M. Wt.= 531.52 g/mol，換算下來，50 µg粉末只需加入94 µL DMSO即可得到1 mM儲存液。

可根據(jù)單次的使用量將儲存液分裝后放到-20℃避光，避免反復凍融。

2工作液的配制

根據(jù)不同的實驗?zāi)康氖褂貌煌奶结槤舛龋韵碌钠鹗疾僮鳁l件僅作參考，可根據(jù)細胞類型和其他的相關(guān)因素如細胞或組織的透化等進行適當調(diào)整。

用適當?shù)木彌_液或者細胞培養(yǎng)基稀釋1 mM儲存液至工作液濃度。一般推薦使用濃度為25-500 nM。對于后續(xù)需要做固定或透化的樣本，推薦工作濃度為100-500 nM，為了降低過度加載導致的潛在偽影和線粒體毒性，在不影響實驗結(jié)果的前提下應(yīng)盡可能低濃度染色。另外，濃度過高也可能對其他細胞結(jié)構(gòu)進行染色。

3染色及檢測

1）壁細胞的染色

培養(yǎng)皿/板內(nèi)加入適量的培養(yǎng)基覆蓋蓋玻片進行爬片培養(yǎng)。當細胞長至所需豐度，吸除培養(yǎng)液，加入37℃預熱的染色工作液。在所使用細胞正常培養(yǎng)條件下孵育15-45 min（*孵育時間需優(yōu)化）。染色結(jié)束后，使用新鮮培養(yǎng)液或緩沖液替換上述染色液，即可將其置于熒光顯微鏡下觀察或熒光酶標儀下讀數(shù)?；蛘哌M行后續(xù)的固定和透化步驟，見步驟4。

2）浮細胞的染色

離心收集細胞，吸除上清，利用37℃預熱的染色工作液輕輕重懸細胞。在所使用細胞正常培養(yǎng)條件下孵育15-45 min（*孵育時間需優(yōu)化）。染色結(jié)束后，離心收集細胞，利用37℃預熱的新鮮培養(yǎng)液或緩沖液重懸細胞，被染色的細胞可用流式細胞儀、熒光酶標儀、熒光顯微鏡進行分析。

如果需要蓋玻片上固定化的細胞，那么可在鋪片前先用多聚賴氨酸（poly-D-lysine）包被載玻片或蓋玻片。

或者進行后續(xù)的固定和透化步驟，見步驟4。

4固定和透化

1）色結(jié)束后，利用培養(yǎng)液或緩沖液清洗細胞；

2）小心吸走清洗液。換用新鮮配制且預熱的含2-4%甲醛的緩沖液或培養(yǎng)液進行細胞固定。經(jīng)驗證，本染料由含3.7%甲醛的*培養(yǎng)液于37℃孵育內(nèi)皮細胞15min能起到良好的固定效果。

3）清洗細胞：吸除固定液，用適當緩沖液沖洗細胞數(shù)次。

4）細胞透化（可選）：

像ICC等實驗需要細胞要做透化，則可將已固定的細胞直接加入含有去污劑如Triton X-100的緩沖液中孵育。透化結(jié)束后，用緩沖液清洗細胞即可進行后續(xù)ICC實驗。經(jīng)檢測，利用含0.2% Triton X-100的PBS孵育內(nèi)皮細胞10min可以達到良好的透化效果。

另外，還可利用預冷的丙酮透化5 min，之后用PBS清洗細胞。經(jīng)驗證，即使后繼沒有進一步的抗體標記，丙酮透化處理也可降低背景信號。

注意事項

1）DMSO有毒，使用時請小心操作。

2）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作

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