D-熒光素專(zhuān)題

原理

D-熒光素（D-Luciferin）是熒光素酶（Luciferase）的常用底物，普遍應(yīng)用于整個(gè)生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是體內(nèi)活體成像技術(shù)。其作用機(jī)制是在ATP和熒光素酶的作用下，熒光素（底物）能夠被氧化發(fā)光。當(dāng)熒光素過(guò)量時(shí)，產(chǎn)生的光量子數(shù)與熒光素酶的濃度呈正相關(guān)性（見(jiàn)下圖）。

將攜帶熒光素酶編碼基因（Luc）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后，導(dǎo)入研究動(dòng)物如大、小鼠體內(nèi)，之后注入熒光素，通過(guò)生物發(fā)光成像技術(shù)（BLI）來(lái)檢測(cè)光強(qiáng)度變化，從而實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)疾病發(fā)展?fàn)顟B(tài)或藥物的治療功效等。也可以利用ATP對(duì)此反應(yīng)體系的影響，根據(jù)生物發(fā)光強(qiáng)度的變化來(lái)指示能量或生命體征。

分類(lèi)

使用方法

（1）體外實(shí)驗(yàn)：

a：儲(chǔ)存液配置：將1 g的D-Luciferin, sodium salt或鉀鹽溶解于33.3 ml水中，制備成30 mg/ml的儲(chǔ)存液?；靹?，0.2μm濾膜過(guò)濾（可吹入惰性氣體，如氮?dú)?，以防止氧化。?80℃避光保存，一年內(nèi)有效。

b：使用：①在冰上避光解凍（若是在冰上比較難解凍，可短暫溫浴，并輕柔混勻）。②用培養(yǎng)基以1:200的比例稀釋儲(chǔ)存液為150μg/ml。③去除培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基直至無(wú)殘留。④待圖像分析前，向細(xì)胞內(nèi)添加1×熒光素工作液，然后進(jìn)行圖像分析（或者細(xì)胞放在37℃短時(shí)間孵育約5min后檢測(cè)可增強(qiáng)信號(hào)）

（2）活體成像：

a：工作液配置：①溶解1 g熒光素鉀鹽或鈉鹽于66.6 ml 無(wú)Ca²⁺和Mg²⁺的DPBS中，配置成15 mg/ml的溶液。②混勻，0.2μm濾膜過(guò)濾（可吹入惰性氣體，如氮?dú)猓苑乐寡趸?。?80℃避光保存，一年內(nèi)有效。

b：使用：①在冰上避光解凍（若是在冰上比較難解凍，可短暫溫浴，并輕柔混勻）。

②按照動(dòng)物體重150 mg/kg進(jìn)行注射，（例如，20 g重的小鼠需要注射200μl ）

③注射入體內(nèi)10-20 min（待光信號(hào)達(dá)到穩(wěn)定平臺(tái)期），再進(jìn)行成像分析。

注：建議對(duì)每只動(dòng)物模型都需要建立熒光素酶動(dòng)力學(xué)曲線，從而確定最高信號(hào)檢測(cè)時(shí)間和信號(hào)平臺(tái)期。

注射方法

（1）腹腔注射：

將底物注射入腹腔中。推薦劑量為150 mg/Kg（例如，20 g重的小鼠需要注射200μl ）。使用25 G的針頭，1 ml注射器。

其方法如下示意圖：

進(jìn)針5 mm，斜向上30^°角。

（2）靜脈注射：

小鼠的靜脈注射通常是在小鼠的尾部或者眼眶靜脈注射。靜脈注射的推薦劑量同腹腔注射，150 mg/Kg。注射液體的最大體積不可超過(guò)血容量的10%。一般對(duì)于20 g 小鼠其血容量為2 ml，故其最大注射量應(yīng)為200μl。使用1 ml注射器26 G針頭，或者使用胰島素注射器28 G針頭，確保注射器中無(wú)氣泡。注射前將動(dòng)物置于加熱燈下約5 min，或者將尾巴浸泡于溫水中以擴(kuò)張血管。操作時(shí)將小鼠固定于鼠筒或者燒杯中，乙醇消毒尾部，緩慢注射。

客戶實(shí)例

TIPE2抗炎因子在乳腺癌動(dòng)物模型中的抗腫瘤治療作用

選自文獻(xiàn)：Zhang Z, Li L, Cao S, et al. Gene delivery of TIPE2 inhibits breast cancer development and metastasis via CD8 +, T and NK cell-mediated antitumor responses[J]. Molecular Immunology, 2017, 85:230.

FAQ

Q1: 熒光素的純度對(duì)實(shí)驗(yàn)有成影響嗎？

A：有影響。99%以上的純度較好。

Q2: 甲蟲(chóng)熒光素和螢火蟲(chóng)熒光素之間有區(qū)別嗎？

A：二者之間沒(méi)有區(qū)別。

Q3: 如何溶解熒光素，其溶液穩(wěn)定嗎？

A：熒光素鉀鹽在水中的溶解度為60 mg/ml，D-Luciferin, sodium salt溶解度為100 mg/ml。熒光素游離酸是不溶于水的，但是在甲醇中的溶解度為10 mg/ml，在DMSO中溶解度為50 mg/ml。

D-Luciferin, sodium salt和鉀鹽的水溶液短期內(nèi)存放于-80℃，對(duì)實(shí)驗(yàn)效果沒(méi)有明顯影響。有實(shí)驗(yàn)證明，將熒光素溶解于脫氧中的水中會(huì)更穩(wěn)定些。

對(duì)于一些較為敏感的試驗(yàn)，為了控制試驗(yàn)中的可變因素，較推薦新鮮配置的反應(yīng)液 。例如，低濃度的熒光素酶或者并非最適的反應(yīng)條件是需要高質(zhì)量的底物才能進(jìn)行反應(yīng)  。

Q4: D-Luciferin, sodium salt和熒光素鉀鹽有什么區(qū)別？

A：目前的研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)二者在使用效果上的區(qū)別，僅在物理特征上有些小的差別，如D-Luciferin, sodium salt鹽溶解度會(huì)高于熒光素鉀鹽。但是在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究中，有更多的研究者傾向于選擇熒光素鉀鹽，據(jù)不統(tǒng)計(jì)，選用鉀鹽的使用人是鈉鹽使用人的3倍。

Q5: D-Luciferin, sodium salt，熒光素鉀鹽，和熒光素游離酸之間有什么區(qū)別？

A：游離酸不溶于水，在甲醇中的溶解度為10 mg/ml，在DMSO中溶解度為50 mg/ml，同樣可用 NaOH，KOH弱堿去調(diào)節(jié)溶液的PH值。熒光素的鈉鹽或者鉀鹽在使用過(guò)程中會(huì)更方便，尤其是在體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)中，因其能夠溶解在水中，反應(yīng)毒性也會(huì)更小些。

Q6: 為什么溶解D-Luciferin, sodium salt或者鉀鹽的時(shí)候需用不含Ca2+或Mg2+離子的PBS，有無(wú)別的鹽溶液可用來(lái)溶解熒光素？

A：PBS，或者其他的磷酸鹽緩沖液，或DPBS，常用來(lái)進(jìn)行生物學(xué)研究或者細(xì)胞相關(guān)研究。PBS/DPBS為等滲溶液，PH為7.2-7.6之間。DPBS和PBS之間無(wú)差別，只是通常情況下，DPBS是不含鈣鎂離子。鈣鎂離子可能會(huì)抑制某些蛋白酶的活性。此外Mg²⁺是催化熒光氧化的重要因素，Ca²⁺是和腔腸素氧化有關(guān)的離子。其他的鹽溶液也可用來(lái)溶解熒光素，但要避免溶液中的陽(yáng)離對(duì)實(shí)驗(yàn)造成影響。

Q7: 熒光素酶的發(fā)光特性？

A：熒光素腹腔注射老鼠后約1 min后，能夠表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞開(kāi)始發(fā)光，10 min后強(qiáng)度達(dá)到穩(wěn)定的最高點(diǎn)，在最高點(diǎn)持續(xù)約20-30 min后開(kāi)始衰減，約3 h后熒光素排除，發(fā)光全部消失，檢測(cè)時(shí)間是在注射后15-35 min內(nèi)。其動(dòng)力學(xué)曲線如下圖：

Q8: 怎么將熒光素注入小鼠體內(nèi)，注射方法之間的區(qū)別是什么？

A：熒光素可通過(guò)腹腔注射或尾部靜脈注射注入小鼠體內(nèi)。約1 min可擴(kuò)散到小鼠全身。大部分情況下使用熒光素濃度為150 mg/kg。對(duì)于20 g的小鼠約使用3 mg的熒光素即可。對(duì)于腹腔注射來(lái)講，擴(kuò)散較慢，開(kāi)始發(fā)光較慢，持續(xù)發(fā)光時(shí)間較長(zhǎng)。對(duì)于熒光素的尾部靜脈注射，擴(kuò)散快，開(kāi)始發(fā)光快，但發(fā)光持續(xù)時(shí)間較短。

Q9: 熒光素底物可以透過(guò)血腦屏障嗎？

A：熒光素底物約280道爾頓，熒光素的水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透細(xì)胞膜和血腦屏障。

Q10: 熒光素酶的表達(dá)穩(wěn)定性如何？

A：通過(guò)穩(wěn)定篩選等過(guò)程，熒光素酶基因是能夠插到細(xì)胞染色體內(nèi)的。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行分裂、轉(zhuǎn)移、分化時(shí)，熒光素酶也得到持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)，熒光素酶的半衰期約為3 h，故只有活細(xì)胞才能持續(xù)表達(dá)熒光素酶。

注意：建議對(duì)每只動(dòng)物模型都需要建立熒光素酶動(dòng)力學(xué)曲線，從而確定最高信號(hào)檢測(cè)時(shí)間和信號(hào)平臺(tái)期。保存和操作的過(guò)程中都要避光。另外水溶性儲(chǔ)存液過(guò)濾除菌后，可以-20℃或-80℃分裝凍存，避免反復(fù)凍融。如果有條件，對(duì)儲(chǔ)存液充氮?dú)饣驓鍤猓ǚ乐寡趸?，穩(wěn)定性和保存時(shí)間更長(zhǎng)，長(zhǎng)達(dá)1年。 注射方式，動(dòng)物類(lèi)型以及體重等都會(huì)影響信號(hào)的發(fā)射，因此建議每次實(shí)驗(yàn)都要做熒光素酶動(dòng)力學(xué)曲線，確定最佳信號(hào)平臺(tái)期和最佳的檢測(cè)時(shí)間。熒光素鉀鹽和鹽應(yīng)用上沒(méi)有差別，兩者的差別在于物理性狀上如外形和溶解性。鈉鹽的水溶性高于鉀鹽。從目前發(fā)表的文獻(xiàn)來(lái)看，鉀鹽的使用率遠(yuǎn)高于鈉鹽，尤其是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。兩者功效相同。 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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