人外周血造血干細(xì)胞分離液試劑盒
產(chǎn)品內(nèi)容：
試劑Ａ 200mL
試劑D 200mL
*（贈(zèng)品） 200mL
清洗液（贈(zèng)品） 200mL
保存：18℃-25℃保存，有效期兩年。本品易感染細(xì)菌，需無菌條件下操作。無菌條件下操作，啟封后常溫保存。如4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
人外周血造血干細(xì)胞分離液試劑盒
操作步驟：
全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在20±2℃的條件下進(jìn)行。首先取抗凝血按體積比1:1的比例加全血及組織稀釋液混勻，根據(jù)稀釋后的樣本量大小，分以下兩種情況：
情況A: 稀釋后血液樣本小于5mL時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：
1. 取一支15ml離心管，依次小心加入試劑A、試劑D（體積比為3:2，試劑總量與稀釋后的血液樣本量相等。如稀釋后的血液樣本為5ml，則先后加入試劑A 3ml、試劑D 2ml），制成梯度界面，各液面分層一定要清晰。
2. 用吸管小心吸取稀釋后的血液樣本加于分離液液面上，400-550g，離心20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長，具體離 心條件需客戶自行摸索，以達(dá)到分離效果）。
3. 離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為五層。*層為稀釋液層。第二層為透明試劑D液層。第三層為環(huán)狀乳白色單核細(xì)胞層。第四層為透明試劑A液層。第五層為紅細(xì)胞層。
4. 用吸管小心吸取第二層試劑D層和第三層乳白色細(xì)胞層到另一15ml離心管中，往所得離心管中加入10ml清洗液，混勻細(xì)胞。
5. 250g，離心10min。
6. 棄上清。
7. 用吸管以5ml清洗液重懸所得細(xì)胞。
8. 250g，離心10min。
9. 重復(fù)6、7、8，棄上清后以0.5ml后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
10. 差異貼壁法純化細(xì)胞
（1） 用單核細(xì)胞無血清培養(yǎng)基或單核細(xì)胞*培養(yǎng)基以1.5-3×106個(gè)/ml的密度重懸細(xì)胞，將細(xì)胞鋪于一次性細(xì)胞板或細(xì)胞瓶中，放于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。
（2） 2-4小時(shí)內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體（俗稱為單核細(xì)胞）。
（3） 10-24小時(shí)內(nèi)貼壁的單個(gè)核細(xì)胞為內(nèi)皮、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞。
（4） 不貼壁的為淋巴細(xì)胞。
注：
a) 無血清培養(yǎng)基中不含任何動(dòng)物成分，為得到更佳培養(yǎng)效果可添加10%自體血漿或2-8%的胎牛血清。
b) *培養(yǎng)基中含2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定）。
c) 由于每種細(xì)胞的貼壁時(shí)間存在差異可將所得細(xì)胞分開已達(dá)簡單的純化目的，此法成本相對較低。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽性或陰性分選。
情況B: 血液樣本大于等于5mL時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：
1. 取一支適當(dāng)?shù)碾x心管，依次小心加入試劑A、試劑D（試劑A與試劑D體積比為5:3，試劑總量與稀釋后的樣本量相等），制成梯度界面。
2. 將經(jīng)稀釋后的血液樣本小心加于分離液之液面上，450-650g（大離心力可至1000g），離心20-30min。（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達(dá)到分離效果。加入血液樣本后，樣本及分離液總體積不得超過離心管總體積的三分之二）。
3. 剩余步驟同“情況A”中步驟3至步驟10。
注意事項(xiàng)：
1. 全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果，取血2h內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，血液存放時(shí)間越長，細(xì)胞分離效果越差。血液放置超過6h后 分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。
2. 稀釋后血液樣本體積小于3ml時(shí)，試劑A和試劑D用量分別為2ml和1ml。
3. 本實(shí)驗(yàn)不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面 會(huì)變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。
4. 吸取過多的單核細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加。
5. 吸取過多的單核細(xì)胞層上層溶液會(huì)導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。
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