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赫爾納貿(mào)易（大連）有限公司
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ELVEFLOW微流控系統(tǒng)在病原微生物核酸快速提取及其微流控進(jìn)展
2023-12-4 閱讀(1023)
細(xì)菌、真菌、病毒等病原微生物威脅著人類健康, 全球每年因食品沙門氏菌污染而患病的有數(shù)百萬人, 機(jī)會致病真菌新生隱球菌每年導(dǎo)致數(shù)十萬人死亡, 病毒造成全球近 700 萬人喪生。準(zhǔn)確鑒別致病微生物是發(fā)現(xiàn)和防治食品安全危害和重大傳染病的重要先決條件。目前通用的病原微生物檢測方法基于核酸擴(kuò)增, 食品的基質(zhì)復(fù)雜且種類不一, 如何從食物樣本中快速、高效地提取病原微生物核酸是亟需解決的技術(shù)挑戰(zhàn), 已成為核酸快速檢測的限速環(huán)節(jié)。微生物核酸通常包裹于堅固的細(xì)胞壁內(nèi), 細(xì)菌細(xì)胞壁主要成分是肽聚糖, 革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁肽聚糖含量較少(僅 1~2 層), 而革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁由厚達(dá) 40~80 nm 的多層肽聚糖(15~50 層)組成, 其細(xì)胞壁厚度也遠(yuǎn)高于革蘭氏陰性細(xì)菌。真菌細(xì)胞壁由多糖和蛋白質(zhì)組成, 主要包括幾丁質(zhì)、葡聚糖和甘露聚糖/半乳甘露聚糖?；诖?/span>, 細(xì)菌和真菌核酸提取相對困難。病毒是結(jié)構(gòu)簡單的非細(xì)胞型微生物, 主要由蛋白質(zhì)外殼和核酸組成。病毒的蛋白質(zhì)外殼稱為核衣殼, 由殼粒組成, 對病毒核酸起保護(hù)作用, 且介導(dǎo)病毒核酸侵入宿主細(xì)胞。病毒蛋白外殼相對脆弱, 核酸提取過程較為容易。
核酸提取微流控芯片
微流控芯片可在微米、毫米尺度完成分離、轉(zhuǎn)移、萃取、吸附、洗滌等復(fù)雜的單元操作, 實現(xiàn)蛋白質(zhì)和核酸等復(fù)雜分子的分離和檢測?；谝旱蔚奈⒘黧w技術(shù)有高通量、并行化、集成化的優(yōu)勢, 已被廣泛用于生物檢測, 如癌癥生物標(biāo)志物、細(xì)胞外分泌物等。為構(gòu)建適用于現(xiàn)場化的病原微生物檢測方法, 微流控芯片的自動化、集成化及高通量過程提供了良好的改進(jìn)手段, 其設(shè)計原理大致如所示。目前, 已有多種核酸提取方法與微流控裝置組合使用, 可簡化操作過程、減少試劑用量、提高檢測效率
微型磁珠微流控芯片
OH 等開發(fā)了一種全集成的自動離心微流控裝置用于多重食源性病原體檢測, 該檢測裝置使用微型珠子輔助提取 DNA, 提高了樣品的處理能力。將磁珠與微芯片相結(jié)合對水傳播病原體進(jìn)行 DNA 提取和檢測, 該方法第一次使用嵌入式振動裝置在 180 Hz 下對芯片上細(xì)胞進(jìn)行裂解, 裂解效率約為 97%。裂解釋放后的 DNA 會與殼聚糖涂覆的納米磁珠結(jié)合形成復(fù)合物, 再用洗滌液除去細(xì)胞碎片和蛋白質(zhì)等得高純 DNA, 提取效率接近 100%。與 TRIzol 法相比(2 h), 該系統(tǒng)提取僅需 15 min 且 DNA 質(zhì)量相近, 并且具有操作簡單、耗時短和高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)。GOWDA 等組合磁珠和硅基研磨珠, 將核酸提取過程設(shè)置于碟式芯片上, 完成從核酸提取、純化、擴(kuò)增的全流程僅需 1 h。利用磁珠法制備的微流控芯片, 其裂解、抽提、純化、檢測等步驟均可集成一體, 具有較大應(yīng)用空間, 但該過程不易滿足高通量檢測要求。
超聲波微流控芯片
超聲波微流控芯片利用表面聲波振蕩驅(qū)動含細(xì)胞微滴碰撞芯片表面來破壞細(xì)胞膜的原理, 釋放細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸。ZHANG 等開發(fā)了一種可在 1 min 內(nèi)從血清樣品提取 HBV 和 HIV 病毒核酸的微流控芯片, 該芯片配備壓力驅(qū)動彈性膜閥, 將微流控通道分成多個室(試劑儲存室、反應(yīng)室), 其核心提取部件為超聲波細(xì)胞裂解和基于二氧化硅膜的固相萃取。該方法效率高, 樣品消耗低, 可在醫(yī)院或生物實驗室中預(yù)處理少量測試樣本。 超聲波微流控芯片利用表面聲波振蕩驅(qū)動含細(xì)胞微滴碰撞芯片表面來破壞細(xì)胞膜的原理, 釋放細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸。ZHANG 等開發(fā)了一種可在 1 min 內(nèi)從血清樣品提取 HBV 和 HIV 病毒核酸的微流控芯片, 該芯片配備壓力驅(qū)動彈性膜閥, 將微流控通道分成多個室(試劑儲存室、反應(yīng)室), 其核心提取部件為超聲波細(xì)胞裂解和基于二氧化硅膜的固相萃取。該方法效率高, 樣品消耗低, 可在醫(yī)院或生物實驗室中預(yù)處理少量測試樣本。
總結(jié)
雖然分子檢測技術(shù)飛速發(fā)展, 多種核酸擴(kuò)增技術(shù)日益成熟, 但核酸快速提取技術(shù)相對落后, 已成為病原微生物現(xiàn)場化檢測亟需解決的痛點(diǎn)問題。病原微生物的核酸提取過程, 實質(zhì)上是將細(xì)菌、真菌、病毒的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜或蛋白質(zhì)外殼破碎, 使其內(nèi)的核酸釋放且收集純化的過程。本文從病原微生物微觀結(jié)構(gòu)著眼, 概述了病原微生物細(xì)胞裂解、核酸提取、核酸純化等全過程大致發(fā)展趨勢, 總結(jié)了快速化提取病原微生物核酸的創(chuàng)新方法及其適用范圍。物理裂解法依賴超聲波、機(jī)械剪切力等相關(guān)設(shè)備, 且得率相對低, 成本較高; 化學(xué)裂解法快速高效, 但對核酸損傷較大, 不利于精確核酸分析; 酶法裂解特異性強(qiáng), 獲取核酸質(zhì)量和得率高, 但消耗時間較長。固相萃取快速高效、性價比高, 是應(yīng)用潛力最大的核酸純化方式之一, 其中纖維素紙基法具有代表性。綜上所述, 病原菌核酸快速提取方法未來可能有三大突破方向。第一, 開發(fā)高親和力吸附核酸的新型載體(如凹凸捧土), 綜合各種裂解方法的優(yōu)勢, 組合創(chuàng)新成為優(yōu)質(zhì)高效方法。本團(tuán)隊融裂解、提取和純化三過程為一體, 正研發(fā)一種集成堿熱裂解和固相萃取相結(jié)合的快速提取方法, 實現(xiàn)一步法高效核酸提取, 現(xiàn)已完成了相關(guān)驗證和配套提取裝置的研發(fā)(待發(fā)表)。第二, 根據(jù)食品基質(zhì)的來源或后續(xù)核酸擴(kuò)增方法的不同, 優(yōu)化設(shè)計出針對性核酸提取方法。例如, 植物基質(zhì)食品采用裂解條件相對劇烈的方法, 而動物性食品采用相對溫和的提取方法。PCR 選用核酸純度較高的方法, 而 LAMP 用粗提核酸即可。第三, 在上述提取方法研究的基礎(chǔ)上, 開發(fā)更為精巧微流控芯片, 進(jìn)一步降低試劑消耗, 提升核酸提取的樣本通量, 增加提取過程的自動化程度, 未來在病原微生物檢測領(lǐng)域中有巨大潛力。
4. 采用微流控制備脂質(zhì)體納米粒的優(yōu)勢
脂質(zhì)體納米粒LNP的傳統(tǒng)制備方法包括沉淀法，乳化法，溶劑蒸發(fā)及超聲波處理等方法，但是傳統(tǒng)制備方法存在粒徑分布廣和批間重復(fù)性差的問題，對藥物開發(fā)的臨床試驗和生產(chǎn)具有很大影響。而微流控技術(shù)是作為制備納米脂質(zhì)體的因為就具有以下優(yōu)勢而引起人們的極大關(guān)注
采用微流控制備脂質(zhì)體納米粒的優(yōu)勢包括：
? 縮短混合時間
? 提高均一性
? 單分散性高（PDI低于0.2）
? 高通量和連續(xù)生產(chǎn)
? 納米顆粒生產(chǎn)的集成和自動化
? 通過精確的流速控制，可實現(xiàn)多種粒徑的單分散納米顆粒
? 多次制備的重復(fù)性好
? 使用同一套流量控制系統(tǒng)合成小體積（μL）和大體積（L）的脂質(zhì)體納米粒
5、影響脂質(zhì)體納米粒合成的因素
大部分納米脂質(zhì)體應(yīng)用都用于抗癌藥物，mRNA，siRNA等包封。納米顆粒的大小決定包封分子數(shù)量，并影響LNP 與細(xì)胞組織的相互作用及釋放動力學(xué)，粒徑的微小差異都可以引起藥物遞送效率的極大不同。此外，粒徑大小分布也會引起包封和釋放效率的不同，因此精確控制納米脂質(zhì)體顆粒的大小和具有低的粒徑分布是及其重要，微流控技術(shù)可以精確控制流體的大小和兩相的比例，從而精確控制粒徑的大小和分布。
合成脂質(zhì)體納米粒非常重要部分是實現(xiàn)有機(jī)相和水相的快速混合，混合的效率和均一性越好，獲得脂質(zhì)體納米粒的大小和分布越精確。
目前常采用兩種類型的微流控芯片進(jìn)行納米脂質(zhì)體的合成，一種是魚骨形芯片，一種是流動聚焦型芯片，這兩種芯片可以實現(xiàn)有機(jī)相和水相的控制和快速混合，乙醇相的快速稀釋可獲得小粒徑的LNP。
納米脂質(zhì)體顆粒的大小不僅取決于所用芯片，而且受脂質(zhì)體溶液組成（類型，分子量大小，濃度等）和水溶液組成（pH，鹽濃度，表面活性劑）以及兩相流速比（FRR）及總流速（TFR）的影響。
FRR( flow rate ratio)是指水相流速和有機(jī)相流速的比，是制備LNP 重要的參數(shù)，依據(jù)經(jīng)驗較高的流速比會合成較小的納米脂質(zhì)體，尤其采用流動聚焦芯片時，FRR影響更大，而使用人字形芯片是，FRR 影響較小。
TFR（total flow rate）是指水相和有機(jī)相和流速之合，當(dāng)使用流動聚焦芯片是，TFR 影響較小，而使用魚骨形芯片時，提高TFR會降低混合時間，從而使得LNP顆粒變小。
有機(jī)相中脂類的組成及脂類的濃度也是覺得脂質(zhì)體顆粒大小的重要因素，一般情況下，高的脂類濃度會合成較小的LNP。其他影響因素還包括pH值，溫度，緩沖液組成等。
6、脂質(zhì)體納米粒合成系統(tǒng)組成
脂質(zhì)體納米粒合成系統(tǒng)需要流量控制系統(tǒng)和微流控芯片，具體包括2通道的OB1 壓力驅(qū)動的流量控制器，2個流量傳感器，2個儲液管以及微流控芯片。采用魚骨形微流控芯片和流動聚焦微流控芯片的具體連接如下圖：
此脂質(zhì)體納米粒合成系統(tǒng)的原理是，連接至壓力源的壓力控制器提供一個穩(wěn)定的壓力數(shù)值，通過管線為密封儲液管施加固定的壓力，從而將儲液管中的液體穩(wěn)定的輸出，并經(jīng)過流量傳感器，流量傳感器測定流量并反饋給壓力控制器，從而達(dá)到精確流量控制的目的，隨后流體被穩(wěn)定、精確的輸送到微流控芯片中，具體參數(shù)可通過電腦上的軟件進(jìn)行控制設(shè)定。2通道的壓力控制器分別控制含脂質(zhì)的乙醇相和水相溶液，兩相溶液可以分別調(diào)節(jié)流速，經(jīng)過流量傳感器和阻尼器后在微流控芯片中混合，從而合成納米脂質(zhì)體，具體可以通過調(diào)節(jié)乙醇相及水相的流速，流速比及總流速，獲得固定粒徑大小的納米脂質(zhì)體
與注射泵相比，此系統(tǒng)中的壓力驅(qū)動控制器具有壓力穩(wěn)定性好，流量精確度高，無脈動，穩(wěn)定時間短，相應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)，是微流控系統(tǒng)中性能最佳的流量控制器，是制備納米脂質(zhì)體顆粒的理想用泵。
此微流控系統(tǒng)是專為研究者設(shè)計的脂質(zhì)體納米粒合成系統(tǒng)，即便沒有微流控和納米脂質(zhì)體合成經(jīng)驗的研究者可以輕松合成納米脂質(zhì)體。依據(jù)簡單直觀的操作指南可以精確控制納米脂質(zhì)體合成的參數(shù)，以100ul/min-30ml/min流速連續(xù)合成脂質(zhì)體，可獲得60-250nm高分散性的納米顆粒。此系統(tǒng)可以根據(jù)客戶需求合成脂質(zhì)體和固體脂質(zhì)體粒以及其他類型的納米顆粒。
