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Pfu DNA聚合酶是Pyrococcus furiosis（激烈火球菌）DNA Polymerase基因在大腸桿菌中表達(dá)并經(jīng)多次過(guò)柱純化分離而得?？捎糜诟弑Ｕ鍼CR、長(zhǎng)鏈PCR的擴(kuò)增，還可以用于DNA片段的粘轉(zhuǎn)平反應(yīng)。
名稱 | 規(guī)格 | 價(jià)格 | 手冊(cè) |
Pfu DNA聚合酶 | 100 U | 50元 |
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Pfu DNA Polymerase是Pyrococcus furiosis（激烈火球菌）DNA Polymerase基因在大腸桿菌中表達(dá)并經(jīng)多次過(guò)柱純化分離而得?？捎糜诟弑Ｕ鍼CR、長(zhǎng)鏈PCR的擴(kuò)增，還可以用于DNA片段的粘轉(zhuǎn)平反應(yīng)。
1. 它具有3'-5'聚合酶活性，跟常用Pfu DNA聚合酶的Taq DNA聚合酶一樣，能夠用于PCR反應(yīng)。
2. 與Taq DNA Polymerase不同的是，它還具有3'-5'外切酶活性，能糾正DNA擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生的堿基錯(cuò)配。
3. 其出錯(cuò)率低的是具有校正功能的耐高溫DNA Polymerase中低的。
4. 比普通Taq DNA 聚合酶熱穩(wěn)定性更好，95℃ 1小時(shí)仍維持90％以上活性。
RNA提取法：試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。當(dāng)加入氯時(shí)，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相，離心后可形成水相層和有機(jī)層，這樣RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開(kāi)。水相層(無(wú)色)主要為RNA，有機(jī)層(黃色)主要為DNA和蛋白質(zhì)。
實(shí)驗(yàn)步驟：
1、RNA的提取;
2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;
3、PCR擴(kuò)增;
4、產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測(cè)定。
RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在zui條件下進(jìn)行。
堿變性提取質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在pH高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)*分離，當(dāng)以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來(lái)的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去。
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