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細(xì)胞凋亡的幾種檢測(cè)方法
2018-10-26 閱讀(826)
一、形態(tài)學(xué)觀察方法
1、HE染色、光鏡觀察：凋亡細(xì)胞呈圓形，胞核深染，胞質(zhì)濃縮，染色質(zhì)成團(tuán)塊狀，細(xì)胞表面有“出芽”現(xiàn)象。
2、丫啶橙（AO）染色，熒光顯微鏡觀察：活細(xì)胞核呈黃綠色熒光，胞質(zhì)呈紅色熒光。凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)呈黃綠色濃聚在核膜內(nèi)側(cè)，可見細(xì)胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。
3、臺(tái)盼藍(lán)染色：如果細(xì)胞膜不完整、破裂，臺(tái)盼藍(lán)染料進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞變藍(lán)，即為壞死。如果細(xì)胞膜完整，細(xì)胞不為臺(tái)盼藍(lán)染色，則為正常細(xì)胞或凋亡細(xì)胞。此方法對(duì)反映細(xì)胞膜的完整性，區(qū)別壞死細(xì)胞有一定的幫助。
4、透射電鏡觀察：可見凋亡細(xì)胞表面微絨毛消失，核染色質(zhì)固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質(zhì)緊實(shí)，細(xì)胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象。
二、DNA凝膠電泳
?。ㄒ唬?、檢測(cè)原理
細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死，其細(xì)胞DNA均發(fā)生斷裂，細(xì)胞內(nèi)小分子量DNA*斷增加，高分子DNA減少，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)DNA*斷。但凋亡細(xì)胞DNA斷裂點(diǎn)均有規(guī)律的發(fā)生在核小體之間，出現(xiàn)180－200bpDNA*斷，而壞死細(xì)胞的DNA斷裂點(diǎn)為無特征的雜亂片斷，利用此特征可以確定群體細(xì)胞的死亡，并可與壞死細(xì)胞區(qū)別。
?。ǘ┙Y(jié)果判斷
正常活細(xì)胞DNA電泳出現(xiàn)階梯狀（LADDER）條帶；壞死細(xì)胞DNA電泳類似血抹片時(shí)的連續(xù)性條帶。
三、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）核小體測(cè)定
凋亡細(xì)胞的DNA斷裂使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA*斷組成，可由ELISA法檢測(cè)。
（一）檢測(cè)步驟
1、將凋亡細(xì)胞裂解后高速離心，其上清液中含有核小體；
2、在微定量板上吸附組蛋白體’
3、加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結(jié)合‘
4、加辣過氧化物酶標(biāo)記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結(jié)合’
4、加酶的底物，測(cè)光吸收制。
（二）用途
該法敏感性高，可檢測(cè)5*100/ml個(gè)凋亡細(xì)胞?？捎糜谌恕⒋笫?、小鼠的凋亡檢測(cè)。該法不需要特殊儀器，適合基層工作，但是不能測(cè)定凋亡細(xì)胞發(fā)生的絕多對(duì)量。
四、流式細(xì)胞儀定量分析
（一）檢測(cè)原理
細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，其細(xì)胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常細(xì)胞與壞死細(xì)胞之間。利用這一特點(diǎn)，被檢測(cè)細(xì)胞懸液用熒光素染色，利用流式細(xì)胞儀測(cè)量細(xì)胞懸液中細(xì)胞熒光強(qiáng)度來區(qū)分正常細(xì)胞、壞死細(xì)胞核凋亡細(xì)胞。
（二）應(yīng)用價(jià)值
流式細(xì)胞儀檢測(cè)具有以下特點(diǎn)：
1）、檢測(cè)的細(xì)胞數(shù)量大，因此其反映群體細(xì)胞的凋亡狀態(tài)比較準(zhǔn)確
2）、可以做許多相關(guān)性分析
3）、結(jié)合被檢測(cè)細(xì)胞的DNA含量的分析，可確定凋亡的細(xì)胞所處的細(xì)胞周期
