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細(xì)胞凋亡的檢測方法
2017-3-9 閱讀(800)
一、形態(tài)學(xué)觀察方法
1、HE染色、光鏡觀察：凋亡細(xì)胞呈圓形，胞核深染，胞質(zhì)濃縮，染色質(zhì)成團(tuán)塊狀，細(xì)胞表面有“出芽”現(xiàn)象。
2、丫啶橙（AO）染色，熒光顯微鏡觀察：活細(xì)胞核呈黃綠色熒光，胞質(zhì)呈紅色熒光。凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)呈黃綠色濃聚在核膜內(nèi)側(cè)，可見細(xì)胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。
3、臺盼藍(lán)染色：如果細(xì)胞膜不完整、破裂，臺盼藍(lán)染料進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞變藍(lán)，即為壞死。如果細(xì)胞膜完整，細(xì)胞不為臺盼藍(lán)染色，則為正常細(xì)胞或凋亡細(xì)胞。此方法對反映細(xì)胞膜的完整性，區(qū)別壞死細(xì)胞有一定的幫助。
4、透射電鏡觀察：可見凋亡細(xì)胞表面微絨毛消失，核染色質(zhì)固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質(zhì)緊實，細(xì)胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象。
二、DNA凝膠電泳
（一）、檢測原理
細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死，其細(xì)胞DNA均發(fā)生斷裂，細(xì)胞內(nèi)小分子量DNA片斷增加，高分子DNA減少，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)DNA片斷。但凋亡細(xì)胞DNA斷裂點均有規(guī)律的發(fā)生在核小體之間，出現(xiàn)180－200bpDNA片斷，而壞死細(xì)胞的DNA斷裂點為無特征的雜亂片斷，利用此特征可以確定群體細(xì)胞的死亡，并可與壞死細(xì)胞區(qū)別。
（二）結(jié)果判斷
正?；罴?xì)胞DNA電泳出現(xiàn)階梯狀（LADDER）條帶；壞死細(xì)胞DNA電泳類似血抹片時的連續(xù)性條帶。
三、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）核小體測定
凋亡細(xì)胞的DNA斷裂使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA片斷組成，可由ELISA法檢測。
（一）檢測步驟
1、將凋亡細(xì)胞裂解后高速離心，其上清液中含有核小體；
2、在微定量板上吸附組蛋白體’
3、加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結(jié)合‘
4、加辣過氧化物酶標(biāo)記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結(jié)合’
4、加酶的底物，測光吸收制。
（二）用途
該法敏感性高，可檢測5*100/ml個凋亡細(xì)胞?？捎糜谌?、大鼠、小鼠的凋亡檢測。
四、流式細(xì)胞儀定量分析
（一）檢測原理
細(xì)胞發(fā)生凋亡時，其細(xì)胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常細(xì)胞與壞死細(xì)胞之間。
（二）應(yīng)用價值
流式細(xì)胞儀檢測具有以下特點：
1）、檢測的細(xì)胞數(shù)量大，因此其反映群體細(xì)胞的凋亡狀態(tài)比較準(zhǔn)確
2）、可以做許多相關(guān)性分析
3）、結(jié)合被檢測細(xì)胞的DNA含量的分析，可確定凋亡的細(xì)胞所處的細(xì)胞周期
■檢測形態(tài)學(xué)及細(xì)胞膜完整性的Hoechs-PI雙染色法
細(xì)胞發(fā)生凋亡時，其細(xì)胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常細(xì)胞和壞死細(xì)胞之間，利用這一特點，被檢測細(xì)胞懸液用熒光素染色，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞懸液中細(xì)胞熒光強(qiáng)度來區(qū)分正常細(xì)胞、壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。
■DNA片斷原位標(biāo)記法
凋亡細(xì)胞DNA片斷原位末端檢測技術(shù)是指在細(xì)胞（或組織）結(jié)構(gòu)保持不變的情況下，用熒光素、生物素標(biāo)記的脫氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，DUTP）和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）相反應(yīng)與凋亡細(xì)胞裂解后3·的羥基（－OH）端結(jié)合，經(jīng)顯色反應(yīng)后檢測DNA裂解點的技術(shù)。
DNA片段原位標(biāo)記法有二種：
1、原位缺口轉(zhuǎn)移（insitunick-translation,ISNT）技術(shù)，它是利用DNA多聚酶I將標(biāo)記的核苷酸連接到斷裂DNA的3·－OH端
2、原位缺口末端標(biāo)記技術(shù)（insituendlabellingtechnique,ISEL），即TUNEL法，它是利用TdT將標(biāo)記的DUPT接到3·-OH端。研究證明，TUNEL法的敏感性遠(yuǎn)高于ISNT，尤其對早期凋亡的檢測，TUNEL更為合適。
■檢測細(xì)胞膜成分變化的AnnexinV聯(lián)合PI法
1、原理：在細(xì)胞凋亡早期位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（PS）遷移至細(xì)胞膜外測。磷脂結(jié)合蛋白V（AnnexinV）是一種鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，它于PS具有高度的結(jié)合力。因此，AnnexinV可以作為探針檢測暴露在細(xì)胞外測的磷脂酰絲氨酸。故利用對PS有高度親和力的AnnexinV，將AnnexinV標(biāo)記上熒光素（如異硫氰酸熒光素FITC），同時結(jié)合使用PI拒染法（因壞死細(xì)胞PS亦暴露于細(xì)胞膜外測，且對PI高染）進(jìn)行凋亡細(xì)胞雙染法后用流式細(xì)胞儀即可檢測凋亡細(xì)胞。
2、結(jié)果判斷：正常活細(xì)胞AnnexinV、PI均低染；凋亡細(xì)胞AnnexinV高染、PI低染；壞死細(xì)胞AnnexinV/PI均高染。
3、應(yīng)用價值：細(xì)胞發(fā)生凋亡時，膜上的PS外露早于DNA斷裂發(fā)生，因此AnnexinV聯(lián)合PI染色法檢測早期細(xì)胞凋亡較TUNEL法更為靈敏。又AnnexinV聯(lián)合PI染色不需固定細(xì)胞，可避免PI染色因固定造成的細(xì)胞碎片過多及TUNEL法因固定出現(xiàn)的DNA片段丟失。
