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江蘇菲亞生物科技有限公司
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江蘇菲亞生物抗血清的純化方法
2017-3-9 閱讀(1083)
抗血清純化的目的是盡量除去抗血清中與目的抗體不相關(guān)的成分，以防止抗體外的其他血清成分對試驗結(jié)果產(chǎn)生影響。因此只能根據(jù)不同目的的要求，從抗血清中除去容易干擾的有關(guān)成分，或提取相應(yīng)的免疫球蛋白。
江蘇菲亞生物的科研人員通過不斷的實驗研究總結(jié)出抗血清純化的方法主要有粗提法和精制法兩個過程。粗提法主要常用硫酸銨鹽析法，精制法分非特異性和特異性兩種類型。非特異性方法如葡聚糖凝膠過濾法、離子交換層析法，其方法均系基于蛋白質(zhì)分子的物理性質(zhì)。特異性方法如免疫吸附法，其方法基于抗原抗體的特異性反應(yīng)。
一、鹽析法
蛋白質(zhì)在不同濃度的鹽溶液中相對溶解度不同，血清γ球蛋白在一定濃度鹽溶液中易于沉淀，而白蛋白則不易沉淀，據(jù)此可將二者分離。
?主要試劑與器材
1.飽和硫酸銨溶液 取500ml蒸餾水加熱至70～80℃，將400g硫酸銨溶于其中，攪拌20min，冷卻。待硫酸銨結(jié)晶沉于瓶底，其上清即為飽和硫酸銨。在使用前用28%氨水調(diào)pH7.0。
2.兔血清(含抗體)。
3.透析袋、離心機等。
?操作方法
用55%飽和硫酸銨提取血清中β、γ球蛋白
⑴血清1份加生理鹽水1份混勻,然后逐滴加入飽和硫酸銨2份中,邊加邊攪拌,防止形成團塊降低沉淀物的特異性.混勻后靜置30min或置4℃冰箱過夜。
⑵低溫高速10 000/min離心10min，將上清液(含白蛋白)棄去，取沉淀物(含球蛋白)溶于少量生理鹽水中。
用33%飽和硫酸銨提取γ球蛋白
將上述提取物生理鹽水溶液2份加1份飽和硫酸銨。然后再10 000/min離心，其余操作同上。
3.按同樣方法用33%飽和硫酸銨再提取1次。
4.將提取物裝入透析袋，在生理鹽水中透析，以除去其中所含的硫酸銨。放-20℃冰箱保存。
?結(jié)果判斷
用雙向免疫擴散法和免疫電泳法檢測抗體活性、效價和純度。
二、凝膠過濾法
?實驗原理
利用具有分子篩效應(yīng)的多孔網(wǎng)狀凝膠做為介質(zhì)，可分離提純分子量不同的大分子物質(zhì)。在凝膠過濾過程中，分子量大的物質(zhì)因不能進入凝膠網(wǎng)孔而沿凝膠顆粒間空隙先流出凝膠柱外；分子量小的物質(zhì)因能進入凝膠網(wǎng)孔而受阻滯，流速緩慢而zui后流出柱外，這樣就能將分子量不同的物質(zhì)分離。
?主要試劑與器材
1.待提純樣品。
2.Sephadex G-200。
3.2.5×100mm層析柱。
4.洗脫液 0.01mol/L pH7.2～7.4PBS(含0.14mol/L NaCl)。
5.751紫外分光光度計。
?操作方法
1.處理凝膠 將Sephadex G-200用蒸餾水竟充分膨脹后進行浮選。
2.裝柱 在層析柱底部鋪加一層尼龍紗，然后將洗脫液和凝膠粒子沿插入柱底的玻璃棒緩緩傾注于層析柱內(nèi)。
3.加樣 在凝膠柱表面再加一層尼龍紗，沿管壁緩緩加入樣品，所加樣品體積不超過凝膠柱的10%。
4.洗脫 洗脫液洗脫，流速20ml/h。待樣品洗脫下來(用20%磺基水楊酸檢測)即用試管分段收集。
5.檢測 在紫外分光光度計上測定各管樣品的A280nm值。
?結(jié)果判斷
以A280nm值為縱軸，收集管次序為橫軸，繪出各洗脫峰，并分別收集各峰的洗脫液，再分別進行蛋白質(zhì)定量與性質(zhì)和純度的鑒定。用已知標(biāo)準(zhǔn)抗體，采用雙向瓊脂擴散試驗、免疫電泳法鑒定蛋白質(zhì)性質(zhì)和純度。
三、離子交換層析法
?實驗原理
離子交換層析是從血清包括抗血清中分離純化IgG的重要方法。它是利用帶電離子的纖維素(如DEAE纖維素)，吸附帶相反電荷的蛋白質(zhì)，又因各種蛋白質(zhì)的等電點不盡相同，在一定pH條件下，所帶電荷量不等，與纖維素結(jié)合的能力有別。當(dāng)用pH7.4磷酸緩沖液(PB)洗脫時，人血清蛋白中IgG所帶電荷zui少，與纖維素結(jié)合zui差，故zui先被洗脫下來，從而可達到分離純化目的。
?主要試劑與器材
1.蒸餾水、0.5mol/L NaOH、0.01mol/L pH7.4 PBS、20%三氯醋酸。
2.混合正常人血清、DEAE纖維素。
3.層析柱、燒杯、pH試紙。
?操作方法
1.用蒸餾水浸泡適量DEAE纖維素過夜，除去飄浮物，再用0.5mol/L NaOH浸泡30min，反復(fù)用蒸餾水洗，可用2 000r/min離心或布氏漏斗抽濾分離，直到洗至約pH7.4，用0.01mol/L pH7.4 PBS再洗一次后裝柱。
2.用相同的PBS平衡至pH7.4，當(dāng)柱上端的PB液凹面與纖維素相切時，加入一定量的血清，待血清滲入柱內(nèi)與柱面相切時，立即沿管壁加少量洗脫液至形成1cm液層后，用0.01mol/L PBS洗脫，控制流速為1ml/min。
3.分管收集,每管吸取少量洗脫液，加20%三氯醋酸測蛋白，合并、保留蛋白含量較高的洗脫液。
4.將含IgG的洗脫液裝入透析袋內(nèi)，用蔗糖或大分子聚乙二醇包埋過夜，水份析出，袋內(nèi)IgG被濃縮。IgG可短期保存于4℃冰箱中備用。
?結(jié)果判斷
用單向免疫擴散試驗測定濃縮液IgG含量，用抗人全血清作免疫電泳測定純度，如純化成功，應(yīng)只在IgG部位出現(xiàn)沉淀線。
為了提高實驗的準(zhǔn)確性,江蘇晶美的科研人員將堅持不懈地努力,為廣大實驗研究人員提供更好的實驗方法,更好的血清產(chǎn)品。
