質(zhì)粒小量提取試劑盒使用說(shuō)明
質(zhì)粒是細(xì)胞內(nèi)的一種環(huán)狀的小分子DNA，是DNA重組的常用載體，在DNA重組中，質(zhì)粒或經(jīng)過(guò)改造后的質(zhì)粒載體可通過(guò)連接外源基因構(gòu)成重組體。在質(zhì)粒提取過(guò)程中，多數(shù)質(zhì)粒粗提取物中含有三種構(gòu)型的質(zhì)粒：共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）、質(zhì)粒的兩條鏈沒(méi)有斷裂、超螺旋開(kāi)環(huán)DNA（ocDNA）、質(zhì)粒的一條鏈斷裂、松弛的環(huán)狀分子線形DNA（lDNA）： 質(zhì)粒的兩條鏈均斷裂；線性分子質(zhì)粒DNA的分子構(gòu)型 。
質(zhì)粒小量提取的方法：
1. 將3~5ml菌液13,000rpm離心30秒收集沉淀（菌體）。 如果用1.5ml或2ml離心管則需反復(fù)離心2～3次。
2. 倒掉上清，將沉淀（菌體）*懸浮于100μl懸 浮液（溶液I）中。上清要盡可能去除干凈，可用濾紙吸干。沉淀要 用混旋器*懸浮，否則將直接導(dǎo)致下一步的裂 解不*，進(jìn)而影響質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量和純度。
3. 加入150μl裂解液（溶液II），輕柔地顛倒混勻10 次左右，溶液逐漸變得粘稠、清亮。不可用混旋器劇烈振蕩，否則會(huì)使質(zhì)粒DNA斷裂； 裂解時(shí)間不宜超過(guò)5分鐘，否則會(huì)造成染色體DNA 的污染及質(zhì)粒DNA的產(chǎn)率降低。
4. 加入150μl中和液（溶液III），輕柔地顛倒混勻10 次左右。 此時(shí)可見(jiàn)到白色絮狀的染色體DNA及細(xì)菌碎片。
5. 13,000rpm離心8~10分鐘，將上清液小心轉(zhuǎn)入一 37個(gè)新的1.5ml離心管中，加入0.4ml純化樹(shù)脂（使 用前充分混勻），顛倒混勻3分鐘。此步是通過(guò)離心去除染色體DNA及細(xì)菌碎片，并使處于高鹽狀態(tài)下的質(zhì)粒DNA與純化樹(shù)脂結(jié)合。
6. 將純化樹(shù)脂及上清液的混合物吸入離心純化柱中，13.000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。
7. 將離心純化柱重新套入廢液收集管中，加入600μl 80%異丙醇（或80%乙醇），13.000rpm離心1分 鐘，倒掉收集管中的廢液。 如果離心純化柱底部殘留有異丙醇（或乙醇），可 用濾紙吸干，否則將影響以后的酶促反應(yīng)。此步 是洗滌質(zhì)粒DNA中混有的雜質(zhì)及鹽類。
8. 重復(fù)第7步1~2次，盡可能將雜質(zhì)去除。
9. 取出離心純化柱，將其套入一個(gè)干凈的1.5ml離 心管，開(kāi)蓋放置2~3分鐘，將殘留的異丙醇(或乙 醇)揮發(fā)干凈。加入50μl TE緩沖液(若用于測(cè)序， 則加50μl超純水)于純化樹(shù)脂上，不能粘在管壁 上。室溫下放置3分鐘后，13,000rpm離心1分鐘。 此步是將純化樹(shù)脂上的DNA洗脫下來(lái)。如果對(duì)質(zhì)粒DNA的需求量較大，則重復(fù)此步驟1～2次，這 樣可以獲得高產(chǎn)量的質(zhì)粒DNA。TE緩沖液或無(wú)菌 超純水的用量視用戶對(duì)濃度的要求而定。離心純化柱放入離心管中，若蓋不上蓋子，亦沒(méi)有關(guān)系,可開(kāi)蓋離心。
10. 離心管中收集的液體即是洗脫下來(lái)的質(zhì)粒 DNA，取1～2μl電泳（0.8%瓊脂糖，120V，15～ 20分鐘）檢測(cè)其純度并目測(cè)定量。 若發(fā)現(xiàn)有RNA 污染，可加入0.5μl RNase A （10mg/ml），37℃保溫30分鐘。此操作不影響其 后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
質(zhì)粒小量提取注意事項(xiàng):
1、使用前請(qǐng)先檢查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出現(xiàn)混濁，如有混濁現(xiàn)象，可在37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復(fù)澄清后再使用。溶液Ⅱ、溶液Ⅲ和漂洗液使用后應(yīng)立即擰緊蓋子。
2、洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50ul，體積過(guò)小影響回收效率;洗脫液的pH值對(duì)洗脫效率也有影晌，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調(diào)至此范圍)，pH值低于7. 0會(huì)降低洗脫效率，DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解。
3、如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)粒或大于10kb的大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體使用量，使用5-10ml過(guò)夜培養(yǎng)物，同時(shí)按照比例增加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量，吸附和洗脫時(shí)可以適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)時(shí)間，以增加提取效率。
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