PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定
實(shí)驗(yàn)原理
生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等常以顆粒分散在溶液中．它們的凈電荷取決于介質(zhì)的H 濃度或與其他大分子的相互作用。在電場(chǎng)中，帶電顆粒向陰極或陽極遷移．遷移的方向取決于它們帶電的符號(hào)．這種遷移現(xiàn)象即謂電泳。遷移的方式目前可以根據(jù)分子尺寸大小、分子所帶的電荷或分子的生物學(xué)與化學(xué)特性分為三類。如果把生物大分子的膠體溶液放在一個(gè)沒有干擾的電場(chǎng)中，使顆粒具有一定遷移速率的驅(qū)動(dòng)力來自于顆粒的有效電荷Q和電位梯度E。它們與介質(zhì)的摩擦阻力f抗衡：在自由溶液中，這種抗衡服從斯托克斯定律。f=6πrvη 這里v是在介質(zhì)粘度為η半徑為r的顆粒的移動(dòng)速度。但在凝膠中，這種抗衡并不*符合斯托克斯定律。f還取決于介質(zhì)小的其他因子，如凝膠厚度、顆粒尺寸、甚至介質(zhì)的內(nèi)滲率等。簡(jiǎn)言之電泳就是帶電顆粒在電場(chǎng)中定向移動(dòng)。
銀染顯色的原理是用甲醛將沉積在DNA帶上的銀離子（*）還原成金屬銀而顯帶。
實(shí)驗(yàn)試劑
1. 聚丙烯酰胺（C=30% T=5%）：丙烯酰胺 28.5g 、 N，N’-二甲基雙丙烯酰胺 1.5g、DDH2O 100ml；
2. 7％聚丙烯酰胺：30％聚丙烯酰胺 23.3ml、10ml 10×TBE溶液、66.7ml DDH2O；
3. 10×TBE溶液：Tris 113g 、硼酸 55g、 1000ml DDH2O；
4. 1×TBE溶液：10×TBE溶液100ml，900ml DDH2O；
5. 10%乙醇；
6. 0.1%硝酸；
7. 0.2%AgNO3：
8. AgNO3 0.15g、DH2O 225ml；
9. 30%NaCO3-甲醛：NaCO3 30g、甲醛 0.85ml；
10. 0.1% AgNO3：AgNO3 1g、1000ml DH2O；
11. 上樣緩沖液：0.25％二甲苯氰藍(lán)、0.25％溴酚藍(lán)；
12. TEMED；
13. 10％過硫酸胺：過硫酸胺1g、10ml DDH2O。
實(shí)驗(yàn)設(shè)備
1. 垂直電泳儀
2. 垂直電泳槽
3. 玻璃
4. 橡膠?？?/p>
5. 點(diǎn)樣梳
6. 搖床
7. 微量進(jìn)樣器
8. 染色托盤
實(shí)驗(yàn)材料
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 電泳槽玻璃板的處理：用洗滌劑清洗玻璃板，自來水反復(fù)沖凈洗滌劑，雙蒸水沖洗3次，烘干，將兩塊玻璃裝入恰當(dāng)?shù)孪鹉z?？騼?nèi)，并組裝好電泳槽（帶長(zhǎng)玻璃的貯液槽為正極，帶短玻璃的貯液槽為陰極）。
2. 制膠：加 35μl TEMED和300μl2.5％過硫酸胺至7％聚丙烯酰胺溶液中混勻。以60O角，緩慢注入兩玻璃板間的空隙中，直至灌滿模具頂部。立即插入相應(yīng)的點(diǎn)樣梳，（小心勿使梳齒下帶進(jìn)氣泡，并且不要將梳齒全部插入膠內(nèi)，留約2mm梳齒于玻璃板上端，以免拔梳時(shí)把膠孔拔斷）。由于凝膠在聚合過程中有回縮，所以應(yīng)小心添加些膠液于梳子處，水平放置，室溫聚合1小時(shí)。向電泳槽內(nèi)灌入 1×TBE電泳緩沖液。小心取出點(diǎn)樣梳，用槽內(nèi)的緩沖液反復(fù)沖洗點(diǎn)樣孔，以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和氣泡。
3. 加樣：取2-4μl擴(kuò)增產(chǎn)物和2μl上樣緩沖液混勻,用微量進(jìn)樣器小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低,則可適當(dāng)增加上樣量,但總體積不可超過樣品槽容量。
4. 電泳：電泳槽接上電極開啟電源，根據(jù)擴(kuò)增片段的大小及電泳槽和凝膠的大小，決定電泳的電壓及電泳時(shí)間。通常室溫下以l～5V／cm電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2cm時(shí),停止電泳。
5. 銀染法顯色：
1) 方法一：
a. 將PAG板浸入10%乙醇溶液固定10min，用純水洗一次；
b. 0.1%硝酸3min，蒸餾水洗兩次。
c. 0.2% AgNO3溶液中10min，用去離子水洗三次；
d. 用30% NaCO3-*顯色至滿意為止，用適量10%冰乙酸終止顯色。
2) 方法二：
a. 取下凝膠，蒸餾水清洗凝膠30秒；
b. 0.1% *染色10分鐘；
c. 棄去染色液，蒸餾水洗膠兩次；
d. 顯色液（顯色液配方：10g NaOH 0.2g Na2CO3 2ml*，定溶到 500ml）顯色至滿意為止。
6. 分型：參照基因階梯的電泳譜帶進(jìn)行分型。
注意事項(xiàng)
1. 每加完一個(gè)樣品要清洗微量進(jìn)樣器,以防止互相污染,注意上樣時(shí)要小心操作,避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。
2. 以二甲苯氰藍(lán)和溴酚藍(lán)的位置大致判斷泳動(dòng)距離，7％聚丙烯酰胺非變性膠中溴酚藍(lán)相當(dāng)于170bp的泳動(dòng)距離，二甲苯氰藍(lán)相當(dāng)于40bp的泳動(dòng)距離。
3. 銀染時(shí)顯色液配制好在4-10 ℃預(yù)冷可以減輕膠板的底色，銀染后膠板在水中漂洗時(shí)間控制在10s以內(nèi)。
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