ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)操作步驟解析
一、樣品的保存
用于ELSIA檢測的樣本非常廣泛，包括各種動(dòng)物組織、動(dòng)物體液以及其他食品提取物等。有些樣本可以直接通過簡單離心、稀釋，有些則需要經(jīng)過理化方法進(jìn)行提取。檢測樣品應(yīng)保證新鮮，經(jīng)前處理的提取液應(yīng)及時(shí)進(jìn)行檢測，時(shí)間越長，提取液中的抗原的效價(jià)越低。如不及時(shí)檢測，應(yīng)及時(shí)放4℃冰箱保存。防止細(xì)菌污染，因菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，可能會(huì)導(dǎo)致假陽性反應(yīng)。如在冰箱中保存過久，其中的HRP可能發(fā)生聚合，在間接法ELSIA檢測中可使本底加深。所以標(biāo)本如需保存做多次檢測，宜采用少量分裝冰箱保存。組織樣本若不及時(shí)做處理，應(yīng)該放置-15℃冰箱保存。
二、試劑的準(zhǔn)備
嚴(yán)格按照試劑盒的說明書的要求準(zhǔn)備好需要用到的試劑。LEISA檢測中應(yīng)采用蒸餾水或者去離子水，洗滌用水應(yīng)新鮮和高質(zhì)量，注意查看是否需要和洗滌液進(jìn)行稀釋。自配的緩沖液應(yīng)用PH計(jì)測量校正。從冰箱取出的試劑必須與室溫平衡方可使用。試劑盒中本次試驗(yàn)不需要的試劑部分及時(shí)放回冰箱保存。
三、加樣
在ELSIA加樣步驟中，應(yīng)加所加物加到ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。加標(biāo)本一般使用微量加樣器，按規(guī)定的量加入孔板中。每次加標(biāo)本必須更換槍頭，以免交叉污染。加酶標(biāo)記物和底物液時(shí)可用定量多道加樣器，使加樣過程迅速完成。
四、溫育
溫育的方式一般采用水浴，可將酶標(biāo)板置于水浴箱中，酶標(biāo)板底貼著水面，是溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā)，酶標(biāo)板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封或者保鮮膜覆蓋板孔，此時(shí)可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。若保溫箱，酶標(biāo)板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性能良好的材料或者如金屬等，在盒底墊濕的紗布，將酶標(biāo)板放在紗布上。這樣能保證穩(wěn)定迅速平衡。無論水浴還是濕盒溫育，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度能迅速平衡。室溫溫育的反應(yīng)，操作時(shí)的室溫要嚴(yán)格限制在室溫的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20℃-25℃，具體的操作時(shí)間根據(jù)說明書的要求嚴(yán)格控制溫育。
五、洗滌
洗滌在ELISA過程中雖然不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但是卻決定著實(shí)驗(yàn)的成敗，ELSIA反應(yīng)就是靠洗滌來達(dá)到將游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物分離的目的。通過洗滌來清洗掉殘留在酶標(biāo)板是未能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，已經(jīng)在反應(yīng)過程中非常特異性地吸附于固相載體上的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料材料對蛋白質(zhì)的吸附石普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來?？梢哉f在ELSIA操作過程中，洗滌是主要的關(guān)鍵技術(shù)，每一次清洗都必須謹(jǐn)慎進(jìn)行，操作者應(yīng)嚴(yán)格按照要求進(jìn)行洗滌。清洗的方式有手工清洗和洗板機(jī)自動(dòng)清洗兩種。下面主要介紹手工清洗方式。
1、吸干或者甩干孔內(nèi)反應(yīng)液
2、用洗滌液洗一遍。（將洗滌液注滿板孔后，即甩去）
3、浸泡，將洗滌液注滿酶標(biāo)孔，放置1-2min，間歇搖動(dòng)，浸泡時(shí)間不可隨意縮短。
4、甩掉孔內(nèi)液體，用清潔毛巾或者吸水紙拍干。
5、重復(fù)3和4步驟，洗滌4次。
六、顯色和比色
顯色是ELSIA中的zui后一個(gè)溫育步驟，此時(shí)酶催化無色底物生產(chǎn)有色產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的zui重要的因素。加入底物后的反應(yīng)時(shí)間和溫度應(yīng)該按規(guī)定嚴(yán)格控制準(zhǔn)確。
七、酶標(biāo)儀讀板
測讀吸光度值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰。有的酶標(biāo)儀可用雙波長讀數(shù)，即每孔先后讀兩次，*次在波長，第二次在不敏感的波長，兩次測讀不移動(dòng)酶標(biāo)板的位置。zui終讀數(shù)得到值為兩者之差，即敏感波長值減去不敏感波長值。雙波長讀數(shù)可以減少由容器壁劃痕或指紋造成的光干擾。
八、結(jié)果判定
根據(jù)實(shí)驗(yàn)讀數(shù)，結(jié)果產(chǎn)品說明進(jìn)行結(jié)果判定。
會(huì)員1.png)