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江蘇菲亞生物科技有限公司

細胞轉(zhuǎn)染技術---瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

時間:2018-4-27閱讀:4799
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    細胞常規(guī)轉(zhuǎn)染技術可分為兩大類,一類是瞬時轉(zhuǎn)染,一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(*轉(zhuǎn)染)。

    瞬時轉(zhuǎn)染(transient transfection)是將DNA導入真核細胞的方式之一。在瞬時轉(zhuǎn)染中,重組DNA導入感染性強的細胞系以獲得目的基因暫時但高水平的表達。轉(zhuǎn)染的DNA不必整合到宿主染色體,可在比穩(wěn)定轉(zhuǎn)染較短時間內(nèi)收獲轉(zhuǎn)染的細胞,并對溶解產(chǎn)物中目的基因的表達進行檢測。

    穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(*轉(zhuǎn)染)是用于建立克隆的細胞系,這種細胞系中轉(zhuǎn)染的目的基因整合到染色體DNA中并指導適量目的蛋白的合成。一般來說(由細胞類型決定),形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的效率比瞬時轉(zhuǎn)染(transient transfection)的效率低1到2個數(shù)量級。利用可選擇的遺傳標記物有利于從非轉(zhuǎn)染細胞的中分離出的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染物。

    前者外源DNA/RNA 不整合到宿主染色體中,因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數(shù),產(chǎn)生高水平的表達,但通常只持續(xù)幾天,多用于啟動子和其它調(diào)控元件的分析。一般來說,超螺旋質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)染效率較高,在轉(zhuǎn)染后24-72 小時內(nèi)(依賴于各種不同的構建)分析結果,常常用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白,β 半乳糖苷酶等來幫助檢測。后者也稱穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,外源DNA 既可以整合到宿主染色體中,也可能作為一種游離體(episome)存在。盡管線性DNA 比超螺旋DNA 轉(zhuǎn)入量低但整合率高。 外源DNA 整合到染色體中概率很小,大約1/104 轉(zhuǎn)染細胞能整合,通常需要通過一些選擇性標記,如氨丙基轉(zhuǎn)移(APH;*抗性基因),潮霉素B 磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反復篩選,得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細胞系。轉(zhuǎn)染技術的選擇對轉(zhuǎn)染結果影響也很大,許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化DNA 與轉(zhuǎn)染試劑比例,細胞數(shù)量,培養(yǎng)及檢測 時間等。一些傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染技術,如DEAE 右旋糖苷法,磷酸鈣法,電穿孔法,脂質(zhì)體法各有利弊。

 

 

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