2016年7月25日，學術刊物自然出版集團旗下子刊《Nature Structural & Molecular Biology》雜志上在線發(fā)表了浙江大學生命科學研究院朱永群實驗室題為“Structural Basis for Cas3 Inhibition by the Bacteriophage Protein AcrF3”的研究論文，研究揭示噬菌體蛋白AcrF3抑制病原菌I型CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)效應分子Cas3的分子機理。國家蛋白質科學中心的姚德強博士和朱永群實驗室博士生王小飛為論文共同*作者，朱永群教授和助理研究員周艷博士為本文的共同通訊作者。

病原菌中廣泛擁有CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)，用于抵抗來自病毒(噬菌體)或者質粒等外源核酸類物質的入侵。其中I型CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)在細菌中存在，其功能主要是由crRNA介導沉默復合物Cascade和DNA降解效應分子Cas3來完成的。Cascade復合物利用其結合的crRNA分子，特異地識別目標DNA，在目標DNA上形成特殊的R-loop結構，并招募下游效應分子Cas3到R-loop上。由于Cas3同時具有核酸酶活性和DNA解旋酶活性，I型CRISPR-Cas系統(tǒng)利用Cas3將目標DNA雙鏈解開并加以降解。在*的細菌與噬菌體相互斗爭和生物共進化過程中，噬菌體也進化出了*的蛋白分子，拮抗細菌宿主CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)，從而促進自身的生存。其中噬菌體JBD5的AcrF3蛋白能夠特異地作用于綠膿桿菌的Cas3效應分子(簡稱PaCas3)，抑制綠膿桿菌的I-F亞型CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)。然而，AcrF3這種*的anti-CRISPR活性的具體分子機制*不清楚。

在這項研究中，朱永群實驗室建立了PaCas3體外核酸酶酶學實驗體系，發(fā)現(xiàn)PaCas3具有很好的多種二價金屬離子依賴的核酸酶活性。進一步的生化實驗揭示AcrF3蛋白在溶液狀態(tài)下形成同源二聚體分子，以高親和力的方式與PaCas3特異地結合，有效地抑制了PaCas3體外核酸酶活性。通過解析2.6埃高分辨率的PaCas3-AcrF3復合物的晶體結構，該研究發(fā)現(xiàn)PaCas3由一個獨立的N端Cas2結構域、HD型核酸酶結構域、SF2型解旋酶結構域(由RecA1和RecA2兩個亞結構域組成)、Long linker區(qū)以及C端結構域(CTD)所構成。單獨的Cas2蛋白被報道在CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)的DNA adaptation(DNA適應)過程中發(fā)揮關鍵作用，Cas2與Cas1形成摩爾比2：4的整合酶復合物，將獲取的外源DNA插入CRISPR基因座中。PaCas3擁有獨立的Cas2結構域，說明PaCas3不同于以往報道的Cas3分子，它同時參與了CRISPR-Cas系統(tǒng)中的DNA適應和DNA干擾兩個過程。

在PaCas3-AcrF3復合物晶體結構中，AcrF3以同源二聚體的方式與PaCas3的緊密結合，這與我們的生化實驗結果*一致。單個AcrF3分子呈現(xiàn)由六股α-螺旋組成的雙層結構，并通過疏水相互作用、以反向對稱的方式形成同源二聚體分子。破壞二聚體中兩個分子之間的疏水作用，將導致AcrF3*喪失了抑制PaCas3體外核酸酶活性的能力。在復合物結構中，AcrF3二聚體結合在PaCas3 的位于Long linker區(qū)與CTD結構域之間的凹槽區(qū)域，并與PaCas3的HD、Long linker區(qū)、RecA2和CTD結構域之間發(fā)生了廣泛的相互作用。其中，AcrF3與RecA2之間的相互作用*封閉了PaCas3解旋酶結構域中DNA結合通道的入口，說明AcrF3的結合導致PaCas3不能接觸由Cascade呈遞來的目標DNA。令人驚訝的是，在復合物結構中，PaCas3解旋酶結構域結合了一個ADP分子，而不是通?；钚越庑附Y合的ATP分子，表明AcrF3將PaCas3鎖定在非活性的狀態(tài)。通過進一步的結構分析，該研究還發(fā)現(xiàn)AcrF3也阻止了Cascade復合物的Cse1亞基對PaCas3的識別作用，導致Cascade不能招募PaCas3。因此，AcrF3蛋白以同源二聚體為活性單元，通過屏蔽PaCas3對目標DNA的接觸、阻斷Cascade復合物Cse1亞基對PaCas3的招募作用以及將PaCas3鎖定在ADP結合的非活性狀態(tài)，從而抑制I型CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)，發(fā)揮其anti-CRISPR活性。

這項研究在上從生化和原子水平揭示了噬菌體蛋白抑制病原菌CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)的作用機制，報道CRISPR-Cas系統(tǒng)效應分子與anti-CRISPR蛋白復合物的三維結構，向人們展示了I-F型CRISPR-Cas系統(tǒng)效應分子Cas3的全新結構特點，對人們了解病原菌與噬菌體相互作用以及細菌CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)分子機制具有重要意義。

AcrF3-PaCas3復合物晶體結構示意圖