平板克隆形成實(shí)驗(yàn)基本步驟：

1、取對(duì)數(shù)生的各組細(xì)胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，并把細(xì)胞懸浮在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中備用。
2、將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，每組細(xì)胞分別以每皿50、100、200個(gè)細(xì)胞的梯度密度分別接種含10mL 37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使細(xì)胞分散均勻。置37℃ 5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周。

3、經(jīng)常觀察，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定細(xì)胞5mL固定15分鐘。然后去固定液，加適量GIMSA應(yīng)用染色液染10～30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

4、將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆，或在顯微鏡（低倍鏡）計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。后計(jì)算克隆形成率。

克隆形成率 =（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%

平板克隆形成試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，適用于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗(yàn)成功的關(guān)鍵是細(xì)胞懸液的制備和接種密度。細(xì)胞一定要分散得好，不能有細(xì)胞團(tuán)，接種密度不能過大。

平板克隆形成試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，適用于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗(yàn)成功的關(guān)鍵是細(xì)胞懸液的制備和接種密度。細(xì)胞一定要分散得好，不能有細(xì)胞團(tuán)，接種密度不能過大。

軟瓊脂培養(yǎng)克隆形成試驗(yàn)基本步驟： 
(1)取對(duì)數(shù)生細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細(xì)胞，作活細(xì)胞計(jì)數(shù)，用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1×106細(xì)胞/L。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求作梯度倍數(shù)稀釋。 

(2)用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個(gè)濃度的低溶點(diǎn)瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40℃中不會(huì)凝固。 

(3)按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。 

(4)按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基在無菌試管中相混以后，再向管中加入0.2mL的細(xì)胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37℃ 5%CO2溫箱中培養(yǎng)10～14天。 

(5)把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞克隆數(shù)。計(jì)算形成率。 軟瓊脂培養(yǎng)法常用檢測(cè)腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。試驗(yàn)中瓊脂與細(xì)胞相混時(shí)，瓊脂溫度不宜超過40℃。接種細(xì)胞的密度每平方厘米不超過35個(gè)，一般6cm的平皿接種1000個(gè)細(xì)胞。正常細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下不能增殖，不適用于軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)。 

軟瓊脂集落形成率實(shí)驗(yàn)(軟瓊脂克隆)   

將1.2％低熔點(diǎn)瓊脂糖與2×細(xì)胞培養(yǎng)基以1:1 的體積比混合制備0.6％的底層瓊脂，6 孔板中每個(gè)孔1.4ml 溫室凝固，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，胰酶消化后吹散成單個(gè)細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，并調(diào)細(xì)胞濃度為10000 個(gè)/ml，將0.6％低熔點(diǎn)瓊脂糖與2×細(xì)胞培養(yǎng)基以1:1 的體積比混合，制備0.3％的上層瓊脂，每孔加1ml 上層瓊脂和100ul 單細(xì)胞懸液（約1000cell/well)，混勻，室溫凝固。置于37℃，5％CO2 的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2－3 周，計(jì)數(shù)含50 個(gè)細(xì)胞以上得克隆，計(jì)算細(xì)胞集落形成率，SpotII 采集圖像。