激光掃描共聚焦顯微鏡（Laser scanning confocal microscope）是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來并得到廣泛應(yīng)用的新技術(shù) [1]  ，它是激光、電子像和計算機(jī)圖像處理等現(xiàn)代高科技手段滲透，并與傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡結(jié)合產(chǎn)生的的細(xì)胞分子生物學(xué)分析儀器，在生物及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)實驗研究的*工具 [2]  。
傳統(tǒng)熒光顯微鏡使用熒光物質(zhì)標(biāo)志細(xì)胞中的特定結(jié)構(gòu)，不僅圖像與背景的對比度增強(qiáng)，而且由于許多熒光顯微鏡的光源使用短波長的紫外光，大大提高了分辨率(δ=0.61·λ/NA，其中δ為顯微鏡的分辨率；λ為照明光線的波長；NA 為物鏡的數(shù)值孔徑)。但當(dāng)所觀察的熒光標(biāo)本稍厚時，傳統(tǒng)熒光顯微鏡一個難以克服的缺點就顯現(xiàn)出來：焦平面以外的熒光結(jié)構(gòu)模糊、發(fā)虛。原因是大多數(shù)生物學(xué)標(biāo)本是層次區(qū)別的重疊結(jié)構(gòu)(如耳蝸基底膜。其實是外毛細(xì)胞 、多種支持細(xì)胞 、神經(jīng)纖維等組成的空間結(jié)構(gòu)),，在普通光學(xué)顯微鏡下聚焦平面的變化， 會表現(xiàn)出不同的形態(tài)。假若熒光標(biāo)記的結(jié)構(gòu)在不同層次上都有分布，且重疊在一起，反射熒光顯微鏡(epifluorescent microscope)不僅從焦平面上收集光量，而且來自焦平面上方或下方的散射熒光也被物鏡所接收，熒光顯微鏡的光學(xué)分辨率就要大大降低 。
在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上，激光掃描共聚焦顯微鏡用激光作為光源，采用共軛聚焦原理和裝置，并利用計算機(jī)對所觀察的對象進(jìn)行數(shù)字圖像處理觀察、分析和輸出。 其特點是可以對樣品進(jìn)行斷層掃描和成像，進(jìn)行無損傷觀察和分析細(xì)胞的三維空間結(jié)構(gòu)[3]。 同時，利用免疫熒光標(biāo)記和離子熒光標(biāo)記探針，該技術(shù)不僅可觀察固定的細(xì)胞、組織切片,還可以對活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、分子、離子及生命活動進(jìn)行實時動態(tài)觀察和檢測，在亞細(xì)胞水平上觀察諸如 Ca2+，pH 值，膜電位等生理信號及細(xì)胞形態(tài)的變化，成為形態(tài)學(xué)、分子細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)等領(lǐng)域中新一代強(qiáng)有力的研究工具 [3]  ，極大地豐富了人們對細(xì)胞生命現(xiàn)象的認(rèn)識。
激光共聚焦顯微鏡結(jié)構(gòu)編輯
激光共聚焦掃描顯微鏡（Confocal laser scanning microscope，CLSM）用激光作掃描光源，逐點、逐行、
逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個物鏡，物鏡的焦點即掃描激光的聚焦點，也是瞬時成像的物點。系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限制在樣品的一個平面內(nèi)。調(diào)焦深度不一樣時，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲于計算機(jī)內(nèi)，通過計算機(jī)分析和模擬，就能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。
在結(jié)構(gòu) [4]  配置上，激光掃描共聚焦顯微鏡除了包括普通光學(xué)顯微鏡的基本構(gòu)造外，還包括激光光源、掃描裝置、檢測器、計算機(jī)系統(tǒng) (包括數(shù)據(jù)采集、處理、轉(zhuǎn)換、應(yīng)用軟件)、圖像輸出設(shè)備、光學(xué)裝置和共聚焦系統(tǒng)等部分 [2]。由于該儀器具有高分辨率、高靈敏度、“光學(xué)切片”（Optical sectioning）、三維重建、動態(tài)分析等優(yōu)點，因而為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)的研究提供了有效手段。此外，CLSM 對熒光樣品的觀察具有明顯的優(yōu)勢，只要能用熒光探針進(jìn)行標(biāo)記的樣品就可用其觀察。
激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細(xì)胞形態(tài)，也可以用于細(xì)胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計以及細(xì)胞形態(tài)的測量, 配合焦點穩(wěn)定系統(tǒng)可以實現(xiàn)長時間活細(xì)胞動態(tài)觀察。
激光共聚焦顯微鏡原理編輯
在普通寬視野光學(xué)顯微鏡中，整個標(biāo)本全部都被水銀弧光燈或氙燈的光線照明，圖像可以用肉眼直接觀察 [5]  。 同時，來自焦點以外的其他區(qū)域的熒光對結(jié)構(gòu)的干擾較大，尤其是標(biāo)本的厚度在 2um 以上時，其影響更為明顯。
激光共聚焦顯微鏡脫離了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的場光源和局部平面成像模式，
圖2 激光掃描共聚焦顯微鏡光路圖
圖2 激光掃描共聚焦顯微鏡光路圖
采用激光束作光源，激光束經(jīng)照明針孔，經(jīng)由分光鏡反射至物鏡，并聚焦于樣品上，對標(biāo)本焦平面上每一點進(jìn)行掃描。 組織樣品中如果有可被激發(fā)的熒光物質(zhì)，受到激發(fā)后發(fā)出的熒光經(jīng)原來入射光路直接反向回到分光鏡，通過探測針孔時先聚焦，聚焦后的光被光電倍增管（PMT）探測收集，并將信號輸送到計算機(jī)，處理后在計算機(jī)顯示器上顯示圖像 [6]  。 在這個光路中，只有在焦平面的光才能穿過探測針孔，焦平面以外區(qū)域射來的光線在探測小孔平面是離焦的，不能通過小孔。因此，非觀察點的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。由于照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點同時聚焦于照明針孔與探測針孔，焦平面以外的點不會在探測針孔處成像，即共聚焦[7]。 以激光作光源并對樣品進(jìn)行掃描，在此過程中兩次聚焦，故稱為激光掃描共聚焦顯微鏡。
應(yīng)用編輯
應(yīng)用功能
激光掃描共聚焦顯微鏡（Confocal laser scanning microscope，CLSM)是近代的細(xì)胞生物醫(yī)學(xué)分析儀器之一。它是在熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見光激光熒光探針，利用計算機(jī)進(jìn)行圖像處理，不僅可觀察固定的細(xì)胞、組織切片，還可對活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、分子、離子進(jìn)行實時動態(tài)地觀察和檢測。目前，激光掃描共聚焦顯微技術(shù)已用于細(xì)胞形態(tài)定位、立體結(jié)構(gòu)重組、動態(tài)變化過程等研究，并提供定量熒光測定、定量圖像分析等實用研究手段，結(jié)合其他相關(guān)生物技術(shù)，在形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)等分子細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域 [7]  得到廣泛應(yīng)用。
組織和細(xì)胞中的定量熒光測定
激光掃描共聚焦顯微鏡可以從固定和熒光染色的標(biāo)本以單波長、雙波長或多波長模式，對單標(biāo)記或多標(biāo)記的細(xì)胞及組織標(biāo)本的共聚焦熒光進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和定量分析,同時還可以利用沿縱軸上移動標(biāo)本進(jìn)行多個光學(xué)切片的疊加， 形成組織或細(xì)胞中熒光標(biāo)記結(jié)構(gòu)的總體圖像,以顯示熒光在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的精確定位。 常用于原位分子雜交、腫瘤細(xì)胞凋亡觀察、單個活細(xì)胞水平的 DNA 損傷及修復(fù)等定量分析。
細(xì)胞間通訊的研究
動物和植物細(xì)胞中縫隙連接介導(dǎo)的胞間通信在細(xì)胞增殖和分化中起著重要作用。 激光掃描共聚焦顯微鏡可通過觀察細(xì)胞縫隙連接分子的轉(zhuǎn)移來測量傳遞細(xì)胞調(diào)控信息的一些離子、小分子物質(zhì)。 該技術(shù)可以用于研究胚胎發(fā)生、生殖發(fā)育、神經(jīng)生物學(xué)、腫瘤發(fā)生等過程中縫隙連接通訊的基本機(jī)制和作用，也可用于鑒別對縫隙連接作用有潛在毒性的化學(xué)物質(zhì)。
細(xì)胞物理化學(xué)測定
激光掃描共聚焦顯微鏡可對細(xì)胞形狀、周長、面積、平均熒光強(qiáng)度及細(xì)胞內(nèi)顆粒數(shù)等參數(shù)進(jìn)行自動測定。 能對細(xì)胞的溶酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞骨架、結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)、DNA、RNA、酶和受體分子等細(xì)胞內(nèi)特異結(jié)構(gòu)的含量、組分及分布進(jìn)行定量、定性、定時及定位測定。
細(xì)胞內(nèi)鈣離子和 pH 值動態(tài)分析
激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)是測量若干種離子濃度并顯示其分布的有效工具，對焦點信息的有效辨別使在亞細(xì)胞水平顯示離子分布成為可能。 利用熒光探針，激光掃描共聚焦顯微鏡可以測量單個細(xì)胞內(nèi) pH 和多種離子(Ca2+、K+、Na+、Mg2+)在活細(xì)胞內(nèi)的濃度及變化。 一般來說，電生理記錄裝置加像技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)離子量變化的速度相對較快,但其圖像本身的價值較低,而激光掃描共聚焦顯微鏡可以提供更好的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中鈣離子濃度動態(tài)變化的圖像,這對于研究鈣等離子細(xì)胞內(nèi)動力學(xué)有意義。
三維圖像的重建
傳統(tǒng)的顯微鏡只能形成二維圖像，激光掃描共聚焦顯微鏡通過對同一樣品不同層面的實時掃描成像，進(jìn)行圖像疊加可構(gòu)成樣品的三維結(jié)構(gòu)圖像。 它的優(yōu)點是可以對樣品的立體結(jié)構(gòu)分析，能十分靈活、直觀地進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,并揭示亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系。
熒光漂白恢復(fù)技術(shù)
該方法的原理是一個細(xì)胞內(nèi)的熒光分子被激光漂白或淬滅，失去發(fā)光能力，而鄰近未被漂白細(xì)胞中的熒光分子可通過縫隙連接擴(kuò)散到已被漂白的細(xì)胞中，熒光可逐漸恢復(fù)。 可通過觀察已發(fā)生熒光漂白細(xì)胞其熒光恢復(fù)過程的變化量來分析細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸、受體在細(xì)胞膜上的流動和大分子組裝等細(xì)胞生物學(xué)過程。
長時程觀察細(xì)胞遷移和生長
活細(xì)胞觀察通常需要一定的加熱裝置及灌注室，以保持培養(yǎng)液的適宜溫度及 CO2 濃度的恒定。 目前的激光掃描共聚焦顯微鏡，其光子產(chǎn)生效率已大大改善，與更亮的物鏡和更小光毒性的染料結(jié)合后可以減小每次掃描時激光束對細(xì)胞的損傷,用于數(shù)小時的長時程定時掃描,記錄細(xì)胞遷移和生長等細(xì)胞生物學(xué)現(xiàn)象。
應(yīng)用領(lǐng)域
在細(xì)胞及分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用
激光掃描共聚焦顯微鏡應(yīng)用照明針與檢測孔共軛成像，有效抑制了焦外模糊成像并可對標(biāo)本各層分別成像，對活細(xì)胞行無損傷的“光學(xué)切片”這種功能也被形象的稱為“顯微 CT”。CLSM 還可以對貼壁的單個細(xì)胞或細(xì)胞群的胞內(nèi)、胞外熒光作定位、定性、定量及實時分析，并對胞內(nèi)成分如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、DNA、RNA、Ca2+、Mg2+、Na+ 等的分布、含量等進(jìn)行測定及動態(tài)觀察，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能方面的研究達(dá)到分子水平。
在腫瘤和抗癌藥物篩選研究中的應(yīng)用
普通顯微鏡及電子顯微鏡，僅能對腫瘤相關(guān)抗原進(jìn)行定性分析，而 CLSM 則可對單標(biāo)記或者多標(biāo)記細(xì)胞、組織標(biāo)本及活細(xì)胞進(jìn)行重復(fù)性的熒光定量分析，從而對腫瘤細(xì)胞的抗原表達(dá)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征，抗腫瘤藥物的作用及機(jī)制等方面定量化 [8-9]  。
在血液病學(xué)和醫(yī)學(xué)免疫學(xué)研究中的應(yīng)用
激光掃描共聚焦顯微鏡觀察免疫細(xì)胞和系統(tǒng)，如樹突狀細(xì)胞、單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)、自然殺傷細(xì)胞、淋巴細(xì)胞時，在準(zhǔn)確細(xì)胞定位的同時有效鑒定免疫細(xì)胞的性質(zhì)。
在大腦和神經(jīng)科學(xué)中的應(yīng)用
激光掃描共聚焦顯微鏡分層掃描發(fā)現(xiàn)神經(jīng)軸突的內(nèi)部結(jié)構(gòu)連續(xù)性好。用激光掃描共聚焦顯微鏡能觀察到腦干組織中神經(jīng)軸突的正常走向，可排除在熒光顯微鏡下由此造成的一些病理假象 [10]  。并且激光掃描共聚焦顯微鏡能觀察神經(jīng)軸突的三維結(jié)構(gòu)，因此應(yīng)用 CLSM 有可能觀察到普通光鏡下未能發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)組織的細(xì)微病變[11]。
在眼科研究中的應(yīng)用
利用激光掃描共聚焦顯微鏡可以觀察晶狀體，角膜、視網(wǎng)膜、虹膜和睫狀體的結(jié)構(gòu)和病理變化[12]。
在骨科研究領(lǐng)域中的應(yīng)用
激光掃描共聚焦顯微鏡在骨科研究領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀表明，CLSM在觀測骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究、骨細(xì)胞特異性蛋白（骨鈣素）以及骨細(xì)胞之間的相互作用具有顯著的優(yōu)勢。
結(jié)語編輯
激光掃描共聚焦顯微鏡作為一項全新的實驗手段和強(qiáng)有力的研究工具，為我們解決一些以往研究工作中不能解決的技術(shù)難題創(chuàng)造了條件，因而必將得到更為廣泛的應(yīng)用。隨著新軟件的不斷開發(fā)及各個學(xué)科 [11-12]  的不斷發(fā)展和相互滲透，相信它還將會有更廣闊的發(fā)展前景。