18017.1 v.A

細(xì)胞色素P450亞酶1A1活性熒光定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

細(xì)胞色素P450亞酶1A1活性熒光定量檢測試劑是一種旨在通過乙氧基異吩噁唑脫乙基酶反應(yīng)系統(tǒng)中乙氧基異吩噁唑轉(zhuǎn)化為羥基異吩噁唑酮后熒光峰值的變化，即采用熒光法來測定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細(xì)胞或組織裂解萃取液樣品（動物、人體）或純化微粒體樣品細(xì)胞色素P450亞酶1A1的總活性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

細(xì)胞色素P450亞酶1A1，簡稱為CYP1A1，又稱芳香族碳?xì)浠衔锛恿u基酶（aryl hydrocarbon hydrorylase；AHH）是肝細(xì)胞微粒體復(fù)合功能氧化酶系統(tǒng)的成員之一。CYP1A1由三個亞型：M1、M2、M3。其作用在于體內(nèi)外源化合物（xenobiotics），包括藥物、致癌劑、化學(xué)污染物的氧化代謝，即單加氧化作用（monooxygenation）和羥化作用（hydroxylation）。芳香族碳?xì)浠衔镎T導(dǎo)CYP1A1的表達(dá)。乙氧基異吩噁唑脫乙基酶（7-ethoxyresorufin O-deacylase；EROD）的活性是細(xì)胞色素P450亞酶1A1的診斷標(biāo)記，其基于EROD選擇性催化細(xì)胞色素P450亞酶1A1的活性。乙氧基異吩噁唑（7-ethoxyresorufin）在乙氧基異吩噁唑脫乙基酶的催化下，轉(zhuǎn)化為羥基異吩噁唑酮（resorufin）后熒光峰值的變化（激發(fā)波長530nm，散發(fā)波長590nm），來定量測定細(xì)胞色素P450亞酶1A1的活性。乙氧基異吩噁唑脫乙基酶反應(yīng)系統(tǒng)為：

          EROD

7－ethoxyresorufin  +  NADPH       →      resorufin  +  NADP⁺

產(chǎn)品內(nèi)容

緩沖液（Reagent A） 25毫升

反應(yīng)液（Reagent B） 2.5毫升

底物液（Reagent C）     500微升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）      50微升

產(chǎn)品說明書      1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，底物液（Reagent C）和標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）避免光照，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于標(biāo)準(zhǔn)樣品配制的容器

恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)

比色皿或黑色96孔板：用于熒光分析的容器

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于熒光分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

• 測定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好待測樣品（例如細(xì)胞裂解萃取液或微粒體樣品等），置于冰槽里
• 設(shè)定好熒光分光光度儀（溫度為37℃）：激發(fā)波長530nm，散發(fā)波長590nm，增益倍數(shù)100 
• 準(zhǔn)備好5個1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號管
• 加入180微升緩沖液（Reagent A）到1號管
• 分別加入100微升緩沖液（Reagent A）到2至5號管
• 移取20微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到1號管，混勻
• 小心移取100微升1號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到2號管，混勻
• 小心移取100微升2號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到3號管，混勻
• 小心移取100微升3號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到4號管，混勻
• 將1至5號管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

• 移取780微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升反應(yīng)液（Reagent B）
• 加入20微升底物液（Reagent C）
• 加入100微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在37℃溫度下孵育10分鐘
• 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測：獲得相對熒光單位（Relative Fluorescence Unit；RFU）
• 重復(fù)實驗步驟1至7四次
• 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為相對熒光單位（RFU）；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)羥基異吩噁唑酮濃度（納摩爾/升）

• 樣品測定

• 移取780微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升反應(yīng)液（Reagent B）
• 加入20微升底物液（Reagent C）
• 加入100微升待測樣品（20微克微粒體蛋白或100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在37℃溫度下孵育10分鐘
• 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測：獲得樣品相對熒光單位（Relative Fluorescence Unit；RFU）
• 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)羥基異吩噁唑酮濃度（納摩爾/升）

• 計算樣品實際活性

[根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)羥基異吩噁唑酮濃度（納摩爾/升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷ 10（分鐘）＝皮摩爾/毫升/分鐘÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝皮摩爾/毫克/分鐘

• 熒光酶標(biāo)儀測定

• 在黑色96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品
• 分別移取195微升緩沖液（Reagent A）到相應(yīng)孔里
• 分別加入25微升反應(yīng)液（Reagent B）
• 分別加入5微升底物液（Reagent C）
• 分別加入25微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液或待測樣品（20微克微粒體蛋白或100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動黑色96孔板
• 在37℃溫度下孵育10分鐘
• 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測：獲得相對熒光單位
• 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為相對熒光單位；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)羥基異吩噁唑酮濃度（納摩爾）
• 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)羥基異吩噁唑酮濃度（納摩爾/升）
• 樣品實際活性計算：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)羥基異吩噁唑酮濃度（納摩爾/升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷ 10（分鐘）＝皮摩爾/毫升/分鐘÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝皮摩爾/毫克/分鐘

注意事項

• 本產(chǎn)品為25次（比色皿）或85次（黑色96孔板）操作，包括標(biāo)準(zhǔn)液
• 操作時，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，標(biāo)準(zhǔn)液測定只需1次
• 樣品須澄清，至關(guān)重要（本公司提供細(xì)胞可溶性總蛋白質(zhì)制備試劑盒30002.1）
• 熒光檢測易受到蛋白的干擾，例如牛血清白蛋白（bovine serum albumin；BSA）會與羥基異吩噁唑酮（resorufin）結(jié)合，導(dǎo)致熒光讀數(shù)的降低
• 如果樣品讀數(shù)低于背景讀數(shù)明顯，建議使用失活的樣品作為樣品背景對照，以及標(biāo)準(zhǔn)樣品測定
• 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光測定
• 如果酶活性過低，可以增加反應(yīng)時間至30分鐘
• 熒光測定后，比色皿須清洗*
• 如果檢測血液樣品，建議使用體外非細(xì)胞系統(tǒng)細(xì)胞色素P450亞酶1A1活性熒光定量檢測試劑盒——18017.2
• 建議待測樣本為微粒體，其蛋白濃度為20微克/100微升；待測樣本為細(xì)胞裂解懸液，其蛋白濃度為100至200微克/100微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 用戶可以使用CYP1A1選擇性抑制劑α-萘黃酮（α-Naphthoflavone）作為陰性對照或抑制劑對照
• 通常人體細(xì)胞微粒體細(xì)胞色素P450亞酶1A1活性濃度為：0.25±0.1皮摩爾/分鐘/毫克蛋白
• 細(xì)胞色素P450亞酶1A1單位活性定義為：在37℃，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠轉(zhuǎn)化1納摩爾乙氧基異吩噁唑至羥基異吩噁唑酮所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列毒理學(xué)檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感

使用承諾

本公司秉著“信譽至上、客戶滿意、質(zhì)量承諾”的宗旨為我們的用戶提供產(chǎn)品和服務(wù)。用戶收到貨后，應(yīng)按照產(chǎn)品說明書上的規(guī)定妥善保管并在有效期內(nèi)使用。我們的產(chǎn)品在銷售前已作嚴(yán)格的質(zhì)量鑒定，保證說明書所述的使用效果。在貨到后10天內(nèi)若發(fā)現(xiàn)確屬本產(chǎn)品的質(zhì)量問題，請立即以書面形式（實驗報告），并將該產(chǎn)品退回，經(jīng)檢驗確系產(chǎn)品質(zhì)量所致，本公司負(fù)責(zé)更換產(chǎn)品。如系使用者錯誤操作所致，本公司不承擔(dān)由此造成的損失。