植物磷脂酶Dα活性酶連續(xù)循環(huán)比色法定量檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品說(shuō)明書

主要用途

植物磷脂酶Dα（Phospholipase Dα）活性酶連續(xù)循環(huán)比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)磷脂酶Dα、膽堿激酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶的酶連續(xù)反應(yīng)系統(tǒng)中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后峰值的降低，即采用比色法來(lái)測(cè)定植物組織裂解樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種植物組織，包括種子（seed）、葉片（leaf）、根（root）、胚胎葉（cotyledon）、上胚軸（epicotyl）等裂解萃取樣品中磷脂酶Dα的活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

磷脂酶（phospholipase），是一種脂質(zhì)水解酶，催化磷脂的水解，產(chǎn)生脂肪酸和其它親脂產(chǎn)物，參與磷脂代謝。磷脂酶家屬有四種類型亞酶，包括A、B、C和D。磷脂酶A（phospholipase A；PLA）主要水解磷脂sn-1（磷脂酶A1催化）和sn-2（磷脂酶A2催化）位置上的乙?；?；磷脂酶B（phospholipase B；PLB）同時(shí)水解磷脂的sn-1和sn-2位置上的乙?；址Q為溶血磷脂酶（lysophospholipase）；磷脂酶C（phospholipase C；PLC）在磷酸基前水解，釋放二酰基甘油（diacylglycerol；DAG）和第二信使分子三磷酸肌醇（inositol triphosphate）；磷脂酶D（phospholipase D；PLD；EC3.1.4.4）在磷酸基后水解，釋放磷脂酸（phosphatidic acid）。植物磷脂酶D，屬于異源性酶（heterogeneous enzyme）家屬成員，與哺乳動(dòng)物磷脂酶D不同，有4個(gè)異構(gòu)體：α、β、γ和δ：PLDα是磷脂酰肌醇4,5二磷酸（phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate；PIP2）-非依賴性的常見的植物PLD酶，而PLDβ和PLDγ是磷酸磷脂酰肌醇輔因子（polyphosphoinositide cofactor）依賴性；PLDγ在氨基酸序列同源性和生化特性上類似于PLDβ；PLDδ為膜相關(guān)性，游離油酸（oleic acid）可以激活。PLDα通過(guò)催化特異性磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine；PC）上磷酸二酯鍵（phosphodiester）的水解，產(chǎn)生磷脂酸和膽堿（choline），磷脂酸作為信號(hào)分子，進(jìn)一步水解為二?；视停c跨膜信號(hào)功能、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)質(zhì)膜的降解和重構(gòu)等有關(guān)。同時(shí)通過(guò)轉(zhuǎn)移磷脂基團(tuán)到原生醇類的羥基上的磷脂轉(zhuǎn)移活性（transphosphatidylation）。PLDα異常將導(dǎo)致細(xì)胞膜損害、細(xì)胞功能缺失、衰老等密切相關(guān)。基于底物磷脂酰膽堿，在磷脂酶Dα的作用下，水解產(chǎn)生為磷脂酸和膽堿后，通過(guò)膽堿激酶（choline kinase）、 丙酮酸激酶（pyruvate kinase）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase）系統(tǒng)，測(cè)定還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）的峰值變化（340nm 波長(zhǎng)），來(lái)定量分析磷脂酶Dα的活性。磷脂酶Dα連續(xù)循環(huán)反應(yīng)系統(tǒng)為：

PLDα 

phosphatidylcholine  +  H2O     →      phosphatidic acid  +  choline

choline kinase

choline  +  ATP  → o-phosphocholine  +   ADP

pyruvate kinase

 ADP  +  phosphoenolpyruvate   →     ATP  +   pyruvate   

lactate dehydrogenase 

 pyruvate  +   NADH    →   lactate  +   NAD^＋ 

（高吸收峰） （低吸收峰）

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）    60毫升

裂解液（Reagent B）  20毫升

緩沖液（Reagent C）   5毫升

反應(yīng)液（Reagent D） 500微升

酶促液（Reagent E） 500微升

底色液（Reagent F）   500微升

陰性液（Reagent G）   500微升

產(chǎn)品說(shuō)明書      1份

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存－20℃冰箱里；底色液（Reagent F）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品保存和反應(yīng)操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

DOUNCE勻漿器：用于組織勻化

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

• 樣品準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定1克組織重量 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎組織
• 放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• 加入預(yù)冷的1毫升裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）
• 將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管，放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）如果上清液含有肉眼可見的殘?jiān)?，重?fù)離心5分鐘一次，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• 即刻移入到1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 BCA蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30031.1）
• 放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

• 測(cè)定準(zhǔn)備

• 開啟并設(shè)定好分光光度儀或酶標(biāo)儀（溫度為30℃）：波長(zhǎng)340nm，并置零 
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；底色液（Reagent F）避免光照
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

• 背景對(duì)照測(cè)定

• 移取170微升緩沖液（Reagent C）到新的1.5毫升離心管
• 加入25微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入10微升陰性液（Reagent G）
• 渦旋震蕩5秒
• 在30℃溫度下孵育10分鐘，期間渦旋震蕩3次，每次5秒
• 煮沸5分鐘
• 室溫下靜置15分鐘冷卻
• 轉(zhuǎn)移到250微升比色皿或96孔板
• 加入25微升酶促液（Reagent E）
• 加入20微升底色液（Reagent F）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀或酶標(biāo)儀檢測(cè)，此為0分鐘讀數(shù)
• 取出比色皿
• 室溫下孵育20分鐘
• 即刻放進(jìn)分光光度儀或酶標(biāo)儀檢測(cè)，此為20分鐘讀數(shù)
• 背景空對(duì)照讀數(shù)＝0分鐘讀數(shù)－20分鐘讀數(shù)

• 樣品活性測(cè)定

• 移取170微升緩沖液（Reagent C）到新的1.5毫升離心管
• 加入25微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入10微升待測(cè)樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 渦旋震蕩5秒
• 在30℃溫度下孵育10分鐘，期間渦旋震蕩3次，每次5秒
• 煮沸5分鐘
• 室溫下靜置15分鐘冷卻
• 轉(zhuǎn)移到250微升比色皿或96孔板
• 加入25微升酶促液（Reagent E）
• 加入20微升底色液（Reagent F）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀或酶標(biāo)儀檢測(cè)，此為0分鐘讀數(shù)
• 取出比色皿
• 室溫下孵育20分鐘
• 即刻放進(jìn)分光光度儀或酶標(biāo)儀檢測(cè)，此為20分鐘讀數(shù)
• 樣品總活性讀數(shù)＝0分鐘讀數(shù)－20分鐘讀數(shù)

• 計(jì)算樣品活性

比色皿計(jì)算

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 0.25（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.01（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 10（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾PC/分鐘

96孔板計(jì)算

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 0.25（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.01（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.6 （光徑距離；厘米）X 10（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾PC/分鐘

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對(duì)照
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次
• 樣品須澄清，至關(guān)重要 
• 測(cè)定值由高到低變化
• 比色測(cè)定后，比色皿須清洗*
• 樣本測(cè)定0分鐘讀數(shù)高于20分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為100微克/10微升；如果樣本酶活性過(guò)低或過(guò)高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供  BCA蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30031.1）
• 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
• 用戶可以使用磷脂酶Dα抑制劑N-月桂酰乙醇胺（N-lauroylethanolamine；12:0；IC50=150納摩爾）作為陰性對(duì)照或抑制劑陽(yáng)性對(duì)照
• 磷脂酶Dα單位活性定義為：在30℃，pH 6.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠水解1微摩爾磷脂酰膽堿所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列磷脂酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感