以下是影響ELISA檢測的關(guān)鍵因素，也是眾多ELISA 用戶在實驗中經(jīng)常遇到的問題及解決方案 ：

Q1：為什么所有試劑和檢測樣本要平衡至室溫后再進行加樣操作？

A1：溫度是ELISA結(jié)合反應(yīng)的重要影響因素。為了使所有樣本在一致的溫度下反應(yīng)，實驗前務(wù) 必將所有試劑平衡至室溫，包括檢測樣本。避免因溫度的動力學(xué)反應(yīng)差異而導(dǎo)致ELISA檢測結(jié) 果的不準確。

Q2：為什么標準曲線線性較差？

A2：按照推薦方式保存標準品；溶解標準品之前需短暫離心，*收集粉末；確保標準品* 溶解和混勻（大約10min），然后再進行后續(xù)的系列稀釋步驟，確保每一步都充分混勻且 移液；顯色的恰當(dāng)終止；選擇合適的數(shù)學(xué)擬合方程繪制標準曲線。

Q3：ELISA實驗為什么必須設(shè)置復(fù)孔？

A3：為獲得更準確的實驗結(jié)果，強烈建議標準品及樣本進行復(fù)孔檢測。 因為復(fù)孔檢測可以：

   ★計算平均值，確保實驗結(jié)果更準確；

   ★解決實驗中誤操作造成的跳孔現(xiàn)象；

   ★計算CV值，對實驗的操作和試劑盒的精密度進行評估。

Q4：為什么實驗過程中孵育、洗滌需要振蕩？如何振蕩？

A4：振蕩孵育使反應(yīng)更充分，振蕩洗滌使背景更干凈。建議使用酶標96孔微孔板振蕩器。 孵育過程振蕩，可以加快、加強抗原抗體間的相互碰撞接觸，使得反應(yīng)過程更加*，OD值通 常會比未振蕩孵育的結(jié)果要高；洗滌過程振蕩，可以使洗板更干凈，在很大程度上能降低背景 值，同時可以提高試劑盒檢測的靈敏度。

Q5：何時終止ELISA反應(yīng)？

A5：ELISA實驗zui終需要酶催化底物顯色反應(yīng)來完成，在zui合適的時間終止反應(yīng)是ELISA實驗成 功的重要因素。在HRP-TMB酶反應(yīng)系統(tǒng)中，當(dāng)zui高濃度標準品顏色不再變深，倒數(shù)2-3個濃度標 準品顏色開始有淺藍色時，便需要終止反應(yīng)；或者也可以根據(jù)zui高濃度標準品孔在620nm的OD 值來決定，OD620=0.9-0.95之間時即可終止。

Q6：為什么酶標儀讀數(shù)時必須選用雙波長？

A6：首先，酶標儀使用前務(wù)必預(yù)熱10-15min，使測讀結(jié)果更穩(wěn)定。其次，ELISA實驗采用雙波 長測定吸光度，可以排除單波長檢測時的測定干擾（標本的濃度，干擾色等）。一般采用zui大 波長作為參照波長，在參照波長下，檢測物的吸光值zui小，檢測波長和參照波長的吸光值之差 可以消除非特異性吸收；因此，雙波長測定，可zui大限度的消除指紋、雜質(zhì)及不透光的物質(zhì)對 酶標儀讀數(shù)帶來的誤差，以保證實驗數(shù)據(jù)的準確度。