線粒體呼吸鏈復(fù)合物I 活性比色法定量檢測試劑盒

產(chǎn)品說明書

主要用途

線粒體呼吸鏈復(fù)合物I（NADH－輔酶Q 還原酶）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在使用合成輔酶Q 同功類似物和特異性抑制劑，通過反應(yīng)系統(tǒng)測定樣品中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后峰值的降低，即采用比色法測定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種純化線粒體樣品（動物、人體、酵母）以及細胞或組織裂解懸液樣品的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）－輔酶Q 還原酶的特異性活性檢測。其用于衰老、能量代謝、蛋白組學、病理生理學、神經(jīng)病變等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測敏感。

技術(shù)背景

線粒體呼吸鏈復(fù)合物I，通常稱為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶Q還原酶（reduced nicotinamide adeninedinucleotide coenzyme Q reductase；NADH-CoQ reductase），又稱為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase；NADH dehydrogenase），是線粒體電子傳遞鏈中zui大的結(jié)構(gòu)成分：含有30至40多個多肽結(jié)構(gòu)。其特征性的酶活性是魚藤酮敏感的NADH－輔酶Q還原酶（NADH:Q Reductase）。復(fù)合物I催化線粒體內(nèi)電子由供體NADH傳遞到內(nèi)膜上輔酶Q受體（泛醌；ubiquinone）的能量轉(zhuǎn)移反應(yīng)，為整個呼吸鏈反應(yīng)系統(tǒng)的*步?；谳o酶Q底物，在魚藤酮存在與否的情

況下，通過NADH－輔酶Q還原酶的催化，轉(zhuǎn)化成還原型泛醌（CoQH2），同時還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamideadenine dinucleotide；NAD），在分光光度儀下產(chǎn)生吸收峰值的變化（340nm 波長），由此定量測定NADH－輔酶Q還原酶的特異活性。其反應(yīng)系統(tǒng)是：

產(chǎn)品內(nèi)容

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；反應(yīng)液（Reagent B）含有毒性物質(zhì)，避免直接用手接觸；反應(yīng)液（ReagentB）和底物液（Reagent D），避免光照，有效保證6 月

用戶自備

比色皿：用于比色分析的容器

雙波長分光光度儀：用于比色分析

培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng)物

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；緩沖液（Reagent A）室溫預(yù)熱；反應(yīng)液（Reagent B）和底物液（Reagent D）注意避光。然后進行下列操作。

一、測定準備

1． 準備好待測樣品（例如純化線粒體樣品等），置于冰槽里（注意：檢測前溶解線粒體；參見注意事項4）

2． 設(shè)定好雙波長分光光度儀（溫度為30℃）：波長分別為340nm 和380nm，間隔30 秒，讀數(shù)7 次（共3分鐘），并置零（注意：參見注意事項10）

二、背景對照測定

1． 移取xx 微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入xx 微升反應(yīng)液（Reagent B）

3． 加入xx 微升底物液（Reagent D）

4． 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3 分鐘

5． 加入xx 微升陰性液（Reagent C）

6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3 秒之內(nèi)）

7． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：

（340 波長讀數(shù)－380 波長讀數(shù)）0 分鐘－（340 波長讀數(shù)－380 波長讀數(shù)）1 分鐘或3 分鐘

三、樣品總活性測定

1． 移取xx 微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入xx 微升反應(yīng)液（Reagent B）

3． 加入xx 微升底物液（Reagent D）

4． 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3 分鐘

5． 加入100 微升待測樣品（注意：10 微克總線粒體蛋白；樣品須溶解；參見注意事項4）

6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3 秒之內(nèi)）

7． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：

（340 波長讀數(shù)－380 波長讀數(shù)）0 分鐘－（340 波長讀數(shù)－380 波長讀數(shù)）1 分鐘或3 分鐘

四、樣品非特異活性測定

1． 移取xx 微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入xx 微升反應(yīng)液（Reagent B）

3． 加入xx 微升專性液（Reagent E）

4． 加入xx 微升底物液（Reagent D）

5． 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3 分鐘

6． 加入100 微升待測樣品（注意：10 微克總線粒體蛋白；樣品須溶解；參見注意事項4）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3 秒之內(nèi)）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數(shù)：

（340 波長讀數(shù)－380 波長讀數(shù)）0 分鐘－（340 波長讀數(shù)－380 波長讀數(shù)）1 分鐘或3 分鐘

五、計算樣品活性

1）樣品活性（總活性或非特異活性）

2）樣品特異活性

注意事項

1． 本產(chǎn)品為30 次（15 個樣本）操作，包括背景對照測定

2． 操作時，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1 次

4． 線粒體樣品檢測前，須溶解；建議凍存融解（－70℃至37℃）循環(huán)3 次或使用線粒體溶解試劑盒

5． 加入樣品啟動反應(yīng)后3 秒內(nèi)即刻比色測定

6． 通常反應(yīng)1 分鐘后比色測定值趨于穩(wěn)定；測定值由高到低變化；測定可以持續(xù)3 分鐘

7． 測定值由高到低變化，即3 分鐘測定讀數(shù)低于0 分鐘測定讀數(shù)，表明有酶活性

8． 比色測定后，比色皿須清洗*

9． 通常比色測定的OD340 起始讀數(shù)0.5 為理想狀態(tài)

10．如果用戶沒有雙波長同步測定分光光度儀，可以使用單波長340nm 替代，注意活性計算時，毫摩爾吸光系數(shù)變成6.2

11．建議待測樣本線粒體蛋白濃度為10 微克/100 微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；注意計算公式的調(diào)整

12．如果使用細胞或組織裂解懸液，則蛋白濃度為50 微克/100 微升

13．樣品特異活性是指魚藤酮敏感的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸－輔酶Q 還原酶，去除其它干擾因素（例如復(fù)合物II/III/IV 等）

14．線粒體呼吸鏈復(fù)合物I（NADH－輔酶Q 還原酶）單位活性定義為：在30℃，pH 7.5 條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1 微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位

15．本公司提供系列線粒體及其酶類技術(shù)產(chǎn)品

質(zhì)量標準

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準確