細(xì)菌銅型亞硝酸鹽還原酶活性比色法定量檢測試劑盒

產(chǎn)品說明書

主要用途

細(xì)菌銅型亞硝酸鹽還原酶活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過底物亞硝酸鹽，在鐵型抑制劑的存在下，被催化產(chǎn)生氨或一氧化氮的同時(shí)，人工電子供體還原型甲基紫精氧化后呈現(xiàn)吸光峰值的變化，即采用比色法來測定樣品中銅型亞硝酸鹽還原酶特異活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)菌細(xì)胞裂解懸液樣品的銅型亞硝酸鹽還原酶的特異活性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，重復(fù)性好。

技術(shù)背景

亞硝酸鹽還原酶（nitrite reductase；NiR）是一類催化亞硝酸鹽為氨或一氧化氮的還原反應(yīng)的酶，其分成同化型（assimilatory）和異化型（dissimilatory）亞硝酸還原酶，在生物氮循環(huán)進(jìn)行厭氧能量代謝中起著重要作用。同化型酶以鐵氧還原蛋白、FAD、非血紅素鐵、西羅血紅素（siroheme）、NAD（P）H等為電子供體，進(jìn)行6個(gè)電子的還原產(chǎn)生氨（ammonification），包括高等植物、綠藻及藍(lán)藻、粗糙脈孢菌（Neur-ospora crassa）、和大腸埃希氏菌（Escherichia coli）等。異化型酶參與使用亞硝酸氧化有機(jī)物質(zhì)的過程，包括單電子反應(yīng)生成NO和6個(gè)電子的還原產(chǎn)生氨。其脫氮作用（denitrification）是細(xì)菌或真菌等獲得能量、適應(yīng)環(huán)境生存的生理過程。脫氮細(xì)菌、真菌或植物的亞硝酸還原酶有二種：銅型和鐵型。銅型（CuNiR）含有類似于銅藍(lán)蛋白（azurin）的銅中心部位，含有2個(gè)銅原子，銅藍(lán)蛋白為電子供體；鐵型（ccNiR）含有同源雙體，分別62Kd，包括c型和d1型細(xì)胞色素結(jié)構(gòu)域，細(xì)胞色素C為電子供體。銅型和鐵型的生理反應(yīng)相同，但同一細(xì)菌互不共有（mutual exclusive）。銅型（EC1.7.2.1），由基因nrfK編碼，主要在無色菌（achromobacter）、沼澤紅假單胞桿菌（rhodopseudomonas）、某種產(chǎn)堿桿菌（alcaligenes）等細(xì)菌周質(zhì)（periplasmic）中存在。基于底物亞硝酸鹽（KNO2），在鐵型抑制劑聯(lián)吡啶（dipyridil）和EDTA以及人工電子供體還原型甲基紫精（methyl viologen）的參與下，受到亞硝酸鹽還原酶的催化產(chǎn)生氨或一氧化氮，同時(shí)還原型甲基紫精轉(zhuǎn)化為氧化型甲基紫精，通過其吸收峰值的變化（600nm波長），來定量分析銅型亞硝酸鹽還原酶的特異活性。其反應(yīng)方式為： 

產(chǎn)品內(nèi)容

保存方式

保存在－20℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于制備樣品的容器

（微型）臺式離心機(jī)：用于樣品處理

恒溫水槽：用于反應(yīng)孵育

酶標(biāo)板或比色皿：用于比色的容器

酶標(biāo)儀或分光光度儀：用于樣品比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、樣品準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好500微升待測細(xì)菌（OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷細(xì)胞/毫升）
• 轉(zhuǎn)移到到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g（或3500RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升裂解液（Reagent A），充分混勻
• 加入xx微升活性液（Reagent B）
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里15分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

• 測讀準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好待測樣品，置于冰槽里融化 
• 設(shè)定好分光光度儀：溫度37℃，波長600nm，間隔1分鐘，測讀6次（共5分鐘），并置零或設(shè)置0分鐘和5分鐘各測讀1次
• 測定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的還原液（Reagent F）和稀釋液（Reagent G）置于冰槽里融化，然后移出xx微升稀釋液（Reagent G）到1管還原液（Reagent F），混勻后，置于冰槽里備用；用畢即刻放進(jìn)－70℃保存
• 測定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的反應(yīng)液（Reagent E）置入冰槽里融化，然后移出40微升到新的1.5毫升離心管，加入xx微升上述新鮮配制的還原液（Reagent F），輕柔混勻后，置于冰槽里，標(biāo)記為反應(yīng)工作液，放在暗室里備用
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

• 背景對照測定

• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升底物液（Reagent D）
• 加入xx微升含有反應(yīng)液（Reagent E）和還原液（Reagent F）的反應(yīng)工作液
• 加入xx微升陰性液（Reagent H）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照（0分鐘讀數(shù)－5分鐘讀數(shù)）：

• 樣品測定

• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升底物液（Reagent D)
• 加入xx微升含有反應(yīng)液（Reagent E）和還原液（Reagent F）的反應(yīng)工作液
• 加入10微升待測樣品（注意：建議總量50微克細(xì)菌總蛋白，且樣品需澄清）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（0分鐘讀數(shù)－5分鐘讀數(shù)）：

• （選擇步驟）樣品活性特異性測定（如果為銅型，則特異活性測定為零）

檢測開始前，移取xx微升緩沖液（Reagent C）到1.5毫升離心管，分別加入xx微升專性液（Reagent I）和待測樣品（注意：50微克細(xì)菌裂解蛋白），混勻后，放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育15分鐘。然后繼續(xù)下列操作。

• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升底物液（Reagent D）
• 加入xx微升含有反應(yīng)液（Reagent E）和還原液（Reagent F）的反應(yīng)工作液
• 加入20微升上述預(yù)處理的待測樣品
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（0分鐘讀數(shù)－5分鐘讀數(shù)）

• 計(jì)算樣品活性

• 酶標(biāo)板測定

（一）樣品活性測定

• 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景空對照和待測樣品
• 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到所有孔里
• 分別加入xx微升底物液（Reagent D）到所有孔里
• 分別加入xx微升含有反應(yīng)液（Reagent E）和還原液（Reagent F）的反應(yīng)工作液
• 分別加入10微升陰性液（Reagent H）或待測樣品（注意：建議總量50微克細(xì)菌總蛋白，且樣品需澄清）到相應(yīng)孔里
• 輕輕搖動96孔酶標(biāo)板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測：獲得吸光讀數(shù)（0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)）
• 計(jì)算樣品酶活性

• （選擇步驟）樣品活性特異性測定（如果為銅型，則特異活性測定為零）

檢測開始前，移取xx微升緩沖液（Reagent C）到1.5毫升離心管，分別加入xx微升專性液（Reagent I）和待測樣品（注意：50微克細(xì)菌裂解蛋白），混勻后，放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育15分鐘。然后繼續(xù)下列操作。

• 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：待測樣品
• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔里
• 加入xx微升底物液（Reagent D）
• 加入xx微升含有反應(yīng)液（Reagent E）和還原液（Reagent F）的反應(yīng)工作液
• 加入20微升上述預(yù)處理的待測樣品
• 輕輕搖動96孔酶標(biāo)板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測：獲得吸光讀數(shù)（0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)）
• 計(jì)算樣品酶活性

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對照
• 操作時(shí)，須戴手套
• 如果需要誘導(dǎo)亞硝酸鹽還原酶的活性，*加入FAD或FAM；第二，密封培養(yǎng)瓶瓶蓋，充入氬氣（argon）培養(yǎng)過夜，確保厭氧狀態(tài)；第三，必要時(shí)加入硫酸銅
• 樣品中避免含有各種還原性化學(xué)物質(zhì)，包括巰基乙醇（2-mercaptoethanol）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol；DTT）、維生素C（ascorbic acid）和*（azide）等
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 加樣后3秒內(nèi)進(jìn)行比色測定
• 樣本測定5分鐘讀數(shù)低于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 比色測定后，比色皿須清洗*
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以增加或減少甚至稀釋樣品量
• 建議待測樣本總蛋白濃度為50微克/10微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量
• 銅型亞硝酸鹽還原酶單位活性定義為：在37℃，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠還原1微摩爾亞硝酸鹽所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列亞硝酸鹽還原酶分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感