細(xì)菌脂肪酶（LIPASE）活性比色法定量檢測試劑盒

產(chǎn)品說明書

主要用途

細(xì)菌脂肪酶（LIPASE）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過底物三丁酸二巰基丙醇受到脂肪酶水解，釋放出巰基基團(tuán)，使用Ellman試劑，產(chǎn)生黃色5-巰基-2-硝基苯甲酸產(chǎn)物吸光峰值的變化，即采用比色法來測定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心改良、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)菌細(xì)胞裂解液樣品脂肪酶的總活性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

脂肪酶（lipase；EC3.1.1.3）是可溶性酶蛋白分子，催化不溶性脂質(zhì)分子的酯鍵（ester bond）的水解。許多細(xì)菌產(chǎn)生細(xì)胞外酶（exoenzyme），稱為水解酶（hydrolase），在水分子的參與下，催化底物的水解，成為細(xì)菌生理特征之一。其中脂肪酶（Lipase），裂解脂肪分子，例如甘油三酯（triglyceride；TAG）、脂肪、油等，產(chǎn)生1個(gè)分子甘油（glycerol）和3個(gè)分子脂肪酸分子（fatty acid），由此用于合成細(xì)菌脂質(zhì)和其它細(xì)胞成分，以及氧化產(chǎn)生能量。食品工業(yè)中，常用于食品發(fā)酵（rancidity），例如人造奶油（margarine）等。甚至用于廚房清潔劑和替代能源的生物催化作用。同時(shí)據(jù)此用以識(shí)別革藍(lán)氏陰性細(xì)菌，例如枯草芽孢桿菌（Bac. Subtilis）等。細(xì)菌脂肪酶在水分子的參與下，催化三丁酸二巰基丙醇（dimercaptopropanol tributyrate；DMPTB或BALB）的水解，產(chǎn)生二巰基丙醇（dimercaptopropanol；DMP），并釋放出巰基基團(tuán)（－SH），與Ellman試劑5，5-二硫基-雙（2-硝基苯甲酸）[5，5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反應(yīng)后，產(chǎn)生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通過其吸收峰值的變化（412nm波長），來定量分析脂肪酶的活性。脂肪酶反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

保存方式

保存 活性液（Reagent B）、 反應(yīng)液（Reagent D）和 底色液（Reagent E）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里； 底色液（Reagent E）避免光照，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備

恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)

比色皿或酶標(biāo)板：用于反應(yīng)和比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好xx微升待測細(xì)菌（OD600＝0.4 至0.8，即1 至2 X 107細(xì)胞/毫升）

2． 轉(zhuǎn)移到到 1.5 毫升離心管

3． 放進(jìn) 4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為1000g（或3500RPM，例如EPPENDORF 5415）

4． 小心抽去上清液

5． 加入 xx 微升  裂解液（Reagent A），充分混勻

6． 加入 xx 微升  活性液（Reagent B）

7． 強(qiáng)力渦旋震蕩 15 秒

8． 置于冰槽里 15 分鐘

9． 放進(jìn) 4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15 分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

10．小心移取xx 微升上清液到新的預(yù)冷的1.5 毫升離心管

11．移取xx 微升進(jìn)行蛋白定量檢測

12．即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測樣品（例如細(xì)菌裂解萃取液等），置于冰槽里

2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為 37℃）：波長412nm，間隔10 分鐘，讀數(shù)4 次（共30 分鐘），并置零

三、背景對照測定

1． 移取 xx 微升  緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升待測樣品（100 微克細(xì)菌細(xì)胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）

3． 上下傾倒數(shù)次，混勻

4． 在 37℃溫度下孵育2 分鐘

5． （選擇步驟）放進(jìn)分光光度儀，置零

6． （選擇步驟）取出比色皿

7． 加入 xx 微升  底色液（Reagent E）

8． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）

9． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照（30 分鐘讀數(shù)－0 分鐘讀數(shù)）

四、 樣品測定

1． 移取 xx 微升  緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升  反應(yīng)液（Reagent D）

3． 加入xx微升待測樣品（100微克細(xì)菌裂解液蛋白）（注意：樣品須清澈）

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在37℃溫度下孵育2分鐘

6． （選擇步驟）放進(jìn)分光光度儀，置零

7． （選擇步驟）取出比色皿

8． 加入xx微升 底色液（Reagent E）

9． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

10．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（30分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

11．（選擇步驟）重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至8，測讀新的樣品

五、計(jì)算樣品活性

單位＝微摩爾DMPTB/分鐘

六、酶標(biāo)板測定

1． 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品

2． 分別移取xx微升 緩沖液（Reagent C）到所有孔中

3． 加入xx微升 反應(yīng)液（Reagent D）到樣品孔里

4． 加入xx微升 陰性液（Reagent F）到背景對照孔里

5． 分別加入xx微升待測樣品（20微克細(xì)菌裂解液蛋白）到所有孔里（注意：樣品須清澈，且pH為7.2）

6． 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板

7． 在37℃溫度下孵育2分鐘

8． 分別加入xx微升 底色液（Reagent E）到所有孔里

9． 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板

10．即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測，包括（0分鐘初始讀數(shù)和30分鐘讀數(shù)）

11．活性計(jì)算

單位＝微摩爾DMPTB/分鐘

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為40次（酶標(biāo)板，包括20次樣品和20次背景對照）和10次（比色皿，包括5次樣品和5次背景對照）操作

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 每次樣品測定，需要背景測定一次

4． 樣品須澄清，至關(guān)重要

5． 樣品中避免含有TWEEN20、NP40、巰基乙醇、DTT等，否則干擾檢測

6． 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行比色測定

7． 比色測定后，比色皿須清洗*

8． 建議待測樣本的蛋白濃度為100微克/50微升

9． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度

10．酶活性單位濃度定義：在37℃下，pH 7.5的情況下，每單位酶在單位時(shí)間內(nèi)（每分鐘）水解1微摩爾三丁酸二巰基丙醇

11．本公司提供系列細(xì)菌生理生化檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感