組織硫代巴比妥酸反應(yīng)物（TBARS）比色法定量檢測試劑盒

產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

組織硫代巴比妥酸反應(yīng)物（TBARS）比色法定量檢測試劑是一種旨在通過TBARS（硫代巴比妥酸反應(yīng)物）技術(shù)，檢測與之反應(yīng)的丙二醛，其產(chǎn)物丙二醛雙硫代巴比妥酸加合物，在分光光度儀下，檢測其吸光峰值的變化，即采用比色法測定組織樣品中硫代巴比妥酸反應(yīng)物含量的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種動物組織（人體、動物、昆蟲等）中硫代巴比妥酸反應(yīng)物的含量檢測。廣泛用于組織氧化應(yīng)急研究，特別是脂質(zhì)過氧化的分析。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，重復(fù)性好。

技術(shù)背景

脂質(zhì)過氧化反應(yīng)（lipid peroxidation；LPO）是動物和植物細胞損傷的一種機制，也是評價細胞和組織氧化應(yīng)急的標志。含有兩個或以上雙鍵（double bond）的多聚不飽和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acid）對自由基以及其它活性氧化族高度敏感，導(dǎo)致產(chǎn)生脂質(zhì)過氧自由基LOO^＋（lipid peroxyl radical），使脂類氧化（lipid oxidation）。脂質(zhì)過氧化自由基LOO^＋同時通過攻擊分子內(nèi)雙鍵，經(jīng)環(huán)化、裂解形成環(huán)狀內(nèi)過氧化物（cyclic endoperoxide），例如丙二醛（malondialdehyde；MDA）和4-羥基壬烯酸（4-hydroxynonenal；HNE）等氫過氧化物（hydroperoxide）和醛（aldehyde），為自然產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，屬于硫代巴比妥酸反應(yīng)物（TBARS）混合物。硫代巴比妥酸反應(yīng)物含量增加，表明氧化應(yīng)急增強。作為脂質(zhì)過氧化性低分子量終端產(chǎn)物之一的丙二醛，廣泛用于脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的指標，即硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substance；TBARS）表述為丙二醛等類物（MDA equivalentlent），以評價脂質(zhì)氧化或氧化應(yīng)急程度。在丁羥甲苯（Butylated Hydroxytoluene；BHT）和EDTA的參與幫助減少干擾性脂類氧化的情況下，丙二醛與硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid；TBA）進行反應(yīng)，產(chǎn)生丙二醛雙硫代巴比妥酸加合物（MDA-TBA2），通過分光光度儀（532nm波長）來定量分析硫代巴比妥酸反應(yīng)物的含量，其反應(yīng)方式為：

產(chǎn)品內(nèi)容

保存方式

保存在4℃冰箱里，抗干擾液（Reagent C）和反應(yīng)液（Reagent E）避免光照，并密封；萃取液（Reagent D）具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于制備樣品的容器

1.5毫升離心管：用于制備樣品和樣品反應(yīng)的容器

超聲儀：用于裂解組織的儀器

（微型）臺式離心機：用于樣品收集、澄清

恒溫水槽：用于反應(yīng)孵育

酶標板：用于比色的容器

酶標儀：用于樣品比色分析

實驗步驟

實驗開始前，將試劑盒中的反應(yīng)液（Reagent E） 置入冰槽里。移取xx微升稀釋液（Reagent G）到 反應(yīng)液（Reagent E）管里，渦旋混勻，標記為反應(yīng)工作液（10次操作量）。同時設(shè)定好酶標儀（溫度為25℃）：波長532nm。然后進行下列操作。

一、樣品準備 

• 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定組織重量 
• （選擇步驟）放進預(yù)冷的50毫升錐形離心管（500毫克組織）
• （選擇步驟）加入xx毫升緩沖液（Reagent A） 
• （選擇步驟）小心抽去緩沖液（Reagent A）
• 移入到一個液氮凍存管
• 即刻放進液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（zui快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進一個15毫升錐形離心管
• 加入置于冰槽里的xx微升裂解液（Reagent B） 
• 強力渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里，置于200瓦超聲儀下，功率50％，猝擊5秒
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為3000g（或6000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• （選擇步驟）移取10微升進行蛋白定量測定，并調(diào)整蛋白濃度為20至50毫克/毫升
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、比色測定

• 準備10個1.5毫升離心管，并做好相應(yīng)標記：背景對照和樣品
• 分別移取xx微升緩沖液（Reagent A） 
• 分別加入xx微升抗干擾液（Reagent C）
• 分別加入xx微升補充液（Reagent F）或待測樣品（注意：總量為1至2毫克總蛋白）
• 用槍頭混勻
• 分別加入xx微升萃取液（Reagent D）
• 用槍頭混勻
• 分別加入xx微升反應(yīng)工作液
• 蓋上蓋子，上下傾倒數(shù)次，混勻
• 放進60℃恒溫水槽，孵育60分鐘
• 放進冰槽里冷卻2分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為10000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 分別移取250微升上清液到96孔酶標板的相應(yīng)孔里（注意：上清須澄清）
• 放進酶標儀檢測 
• 樣品實際讀數(shù)：（樣品讀數(shù)－背景對照讀數(shù)） 

三、計算樣品總濃度

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 用戶可以采用組織勻漿（30秒）處理代替超聲處理
• 萃取液（Reagent D）具有腐蝕性，注意操作安全
• 反應(yīng)液（Reagent E）為固體，避免在室溫下放置；配制后，有效期1周
• 抗干擾液（Reagent C）和反應(yīng)液（Reagent E）避免光照，并密封
• 本產(chǎn)品檢測敏感度可達0.05微摩爾丙二醛等類物
• 50微摩爾的過氧化氫和0.25摩爾蔗糖會干擾檢測（使丙二醛減少13％）
• 如果樣品含有過高的蛋白成分，建議進行樣品去蛋白處理
• 可以使用煮沸10分鐘替代60℃孵育反應(yīng) 60分鐘
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 正常樣品的硫代巴比妥酸反應(yīng)物濃度相當?shù)?，約在皮摩爾水平，即10至100皮摩爾/毫克蛋白
• 本公司提供系列丙二醛檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感