組織鈣離子濃度熒光定量檢測試劑盒

說明書（中文版）

主要用途

組織鈣離子濃度熒光定量檢測試劑是一種旨在通過鈣離子特異性熒光探針Fluo-4，與鈣離子結(jié)合后，其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，在熒光分光光度儀下觀察相對(duì)熒光峰值的變化，來測定組織裂解懸液中總鈣離子濃度的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種組織（動(dòng)物、人體等）裂解萃取樣品中總鈣離子的濃度檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，檢測敏感。

技術(shù)背景

鈣是人體中的一種重要電介質(zhì)和礦物質(zhì)，占1150克。其中99％的鈣以氟磷灰石鈣（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于骨組織中。非骨組織鈣成分主要存在于細(xì)胞內(nèi)。鈣具有兩種主要形式：一種是非彌散型蛋白結(jié)合鈣，其構(gòu)成約40％至50％的血清中的總鈣含量；另一種為彌散型游離鈣，其進(jìn)一步分成具有活性的復(fù)合鈣（complexed calcium）和離子鈣（ionized calcium）。鈣對(duì)神經(jīng)肌肉興奮性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、離子跨膜運(yùn)輸、釋放神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)、信使傳導(dǎo)等方面起著重要作用。鈣的檢測包括沉淀法、EDTA鰲合滴定法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等技術(shù)，但容易受到鈉、鉀、磷酸鹽、硫酸鹽的干擾，或者受限于儀器的特殊的要求。Fluo-4，一種與鈣離子結(jié)合，其熒光強(qiáng)度迅速增強(qiáng)100倍的熒光探針，可以敏感測定微量游離鈣離子水平。在熒光分光光度儀下，激發(fā)波長485nm，散發(fā)波長520nm，來定量測定組織細(xì)胞的鈣濃度。

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）      毫升

裂解液（Reagent B） 毫升

反應(yīng)液（Reagent C）      毫升

飽和液（Reagent D）      毫升

陰性液（Reagent E）      毫升

產(chǎn)品說明書  1份

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent C）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品沉淀

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育

酶標(biāo)板：用于樣品熒光測定的容器

熒光酶標(biāo)儀：用于樣品熒光分析

實(shí)驗(yàn)步驟

• 樣品準(zhǔn)備

• 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定500毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一個(gè)液氮凍存管
• 即刻放進(jìn)液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（zui快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
• 加入預(yù)冷的xx微升裂解液（Reagent B） 
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻
• 置于冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時(shí)停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?/span>
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

• 測定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好上述制備的待測樣品，置于冰槽里備用
• 設(shè)定好熒光酶標(biāo)儀（22℃）：激發(fā)波長485nm，散發(fā)波長520nm

三、熒光測定

• 準(zhǔn)備1個(gè)96孔酶標(biāo)板，標(biāo)記為：樣品孔、空白對(duì)照孔、zui大對(duì)照空
• 移取xx微升（20微克蛋白）上述制備的樣品到樣品孔里
• 移取xx微升飽和液（Reagent D）到zui大對(duì)照空里
• 移取xx微升陰性液（Reagent E）到空白對(duì)照空
• 分別加入xx微升反應(yīng)液（Reagent C）到所有孔里
• 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板，混勻
• 室溫下（22℃），孵育30分鐘，避免光照
• 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀測讀：獲得相對(duì)熒光單位（relative fluorescence unit；RFU） 
• 計(jì)算樣品鈣離子濃度（注意：不要遺忘乘上稀釋倍數(shù)）

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 避免使用EDTA等處理樣品 
• 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光測定
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 檢測敏感度可達(dá)納摩爾級(jí)鈣濃度范圍
• 樣品濃度可以按照蛋白量或組織量定義
• 本公司提供系列鈣生化檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感