植物細胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧超氧陰離子紅色熒光測定試劑盒

產(chǎn)品說明書

主要用途

植物細胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧超氧陰離子紅色熒光測定試劑是一種旨在通過透膜熒光染色劑二氫溴化乙啶，在細胞氧化條件下，產(chǎn)生紅色熒光，來檢測細胞內(nèi)超氧陰離子活性氧族的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種其適用于新鮮植物組織（例如根尖、葉片等）和培養(yǎng)細胞等細胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧的分析。可以被用于細胞凋亡、信號傳遞、衰老和代謝等的研究。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡易，活體檢測，性能穩(wěn)定，滯留持久，熒光清晰。

技術(shù)背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細胞衰老或凋亡。二氫溴化乙啶（Dihydroethidium bromide；Hydroethidine；DHE）是一種*自由通過細胞膜，并在細胞內(nèi)滯留而不外漏的染色劑。一旦被超氧自由基陰離子氧化，二氫溴化乙啶轉(zhuǎn)化為溴化乙啶，進入細胞核，與DNA緊密結(jié)合，便產(chǎn)生熒光。據(jù)此證明細胞內(nèi)超氧陰離子活性氧族的存在。

產(chǎn)品內(nèi)容

保存方式

保存染色液（Reagent D）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；固著液（Reagent B）和離析液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月

用戶自備

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液：用于細胞脫離

*細胞培養(yǎng)液：用于細胞操作所需的培養(yǎng)基

15毫升錐形離心管：用于細胞操作的容器

1.5毫升離心管：用于染色液配制的容器

載玻片：用于組織染色操作

解剖針：用于植物組織解剖

血細胞計數(shù)儀：用于細胞計數(shù)

（微型）臺式離心機：用于樣品處理

培養(yǎng)箱：用于染色孵育

比色皿或酶標(biāo)板：用于熒光定量分析的容器

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于熒光分析

細胞流式儀：用于用于細胞染色分析

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于熒光定量分析

實驗步驟

方法一：活體組織染色

• 加上xx微升清理液（Reagent A）在載玻片上
• 切取新鮮植物根尖，放進載玻片上的清理液（Reagent A）中
• 用解剖針小心壓碎根尖
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）在根尖上
• 再加上xx微升染色液（Reagent D） 
• 放進37℃培養(yǎng)箱里孵育20分鐘
• 取出載玻片，移去染色液
• 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 蓋上蓋玻片，用拇指小心且垂直加壓
• 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進行觀察：激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長590nm――紅色熒光增強，表明超氧陰離子含量高

方法二：組織固定染色

• 加上xx微升清理液（Reagent A）在載玻片上
• 切取新鮮植物根尖，放進載玻片上的清理液（Reagent A）中
• 用解剖針小心壓碎根尖
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 小心加上xx毫升固著液（Reagent B）
• 室溫下，孵育3小時，避免干化
• 小心移去固著液（Reagent B）
• 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 小心加上xx毫升離析液（Reagent C）
• 室溫下孵育5分鐘
• 小心移去離析液（Reagent C）
• 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）
• 小心移去清理液（Reagent A）

• 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）在根尖上
• 再加上xx微升染色液（Reagent D） 
• 放進37℃培養(yǎng)箱里孵育20分鐘
• 取出載玻片，移去染色液
• 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 蓋上蓋玻片，用拇指小心且垂直加壓
• 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進行觀察：激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長590nm――紅色熒光增強，表明超氧陰離子含量高

方法三、培養(yǎng)植物細胞脫離染色

• 準備1瓶25cm²細胞培養(yǎng)瓶的待測細胞
• 小心抽去細胞培養(yǎng)液
• 加入xx毫升 清理液（Reagent A）到細胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面
• 小心抽去清理液（Reagent A）
• 加入1毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養(yǎng)平面
• 置入37℃培養(yǎng)箱1分種
• 振動培養(yǎng)瓶，使細胞脫落
• 加入4毫升用戶自備的*細胞培養(yǎng)液
• 移入15毫升錐形離心管，充分混勻（注意：懸浮細胞直接從這一步驟開始）
• 移取10微升在血細胞計數(shù)儀上進行細胞計數(shù)
• 移出1 X 10⁶細胞到新的15毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升清理液（Reagent A）
• 再加入xx微升染色液（Reagent D），混勻
• 放進37℃恒溫水槽孵育20分鐘，避免光照
• 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入預(yù)冷的xx微升清理液（Reagent A），輕柔混勻細胞顆粒群
• 放進冰槽里
• 選擇下列方式之一進行操作：
  • 即刻進行細胞流式儀分析：藻紅蛋白（phycoerythrin；PE）波段，觀察50000個細胞以上――

波峰右移，表明超氧陰離子含量高

• 或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：

1）移取10微升上述細胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片

2）激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長590nm――

紅色熒光增強，表明超氧陰離子含量高

• 或使用熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀檢測（定量檢測）：

1）移取400微升上述細胞懸液到1毫升比色皿

2）加入xx微升清理液（Reagent A）

3）上下傾倒混勻數(shù)次

4）放進熒光分光光度儀：激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長590nm――

RFU增高，表明超氧陰離子含量高

方法四、貼壁培養(yǎng)細胞染色

• 準備1個細胞培養(yǎng)24孔板的待測細胞，細胞鋪滿率達70％

（注意：可以使用載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm培養(yǎng)皿，和其它培養(yǎng)孔板，見注意事項4）

• 小心抽去細胞培養(yǎng)液
• 小心沿著孔壁加入xx微升清理液（Reagent A）到1個細胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面
• 再加入xx微升染色液（Reagent D）
• 放進37℃細胞培養(yǎng)箱里孵育20分鐘
• 小心抽去染色液 
• 小心沿著孔壁加入xx微升37℃預(yù)熱的清理液（Reagent A）到細胞培養(yǎng)孔
• 選擇下列方式之一進行操作：

（A）使用倒置熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：

激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長590nm――紅色熒光增強，表明超氧陰離子含量高

• 使用熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀檢測（定量檢測）：

放進熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長590nm――RFU增高，表明超氧陰離子含量高

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 固著液（Reagent B）和離析液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全
• 孵育時，必須避免光照
• 建議染色完成后，即刻進行熒光檢測分析
• 本產(chǎn)品適合各種規(guī)格的培養(yǎng)細胞：載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm培養(yǎng)皿，和各種培養(yǎng)孔板，須相應(yīng)調(diào)整操作用量：

• 本產(chǎn)品適合活體染色和固定染色，染色劑不易洗掉，染色持久
• 根據(jù)不同組織類型，調(diào)整染色液（Reagent D）的使用劑量（1：100至1：1000容量比），避免過度染色
• 本公司提供系列活性氧分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰