體液基質(zhì)金屬蛋白酶 14（MMP-14）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過含硫多肽底物以及特定抑制劑存在與否的情況下，受到 MMP-14 的水解，釋放出巰基，進(jìn)而使用 Ellman 試劑，產(chǎn)生黃色 5-巰基-2-硝基苯甲酸產(chǎn)物吸光峰值的變化，即采用比色法來測定體液樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種動物和人體體液包括血漿、血清、尿液、腦脊液、唾液、精液等樣品中基質(zhì)金屬蛋白酶 14 的特異活性定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，安全可靠。

 技術(shù)背景

基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases；MMPs）是一類結(jié)構(gòu)高度同源的分泌型或膜相關(guān)性鋅內(nèi)肽酶的總稱，因含有金屬（鋅、鈣）離子而得名。其功能在于分解細(xì)胞外基質(zhì)成分。迄今為止發(fā)現(xiàn)的MMPs至少有28種，幾乎能降解除多糖以外的全部細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix）成分，同時參與胚胎發(fā)育、形態(tài)形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、組織再吸收（tissue resorption）、疾病發(fā)生，例如關(guān)節(jié)炎、癌細(xì)胞浸入轉(zhuǎn)移等。

 產(chǎn)品內(nèi)容

緩沖液（Reagent A） 毫升

反應(yīng)液（Reagent B） 毫升

底物液（Reagent C） 微升

陰性液（Reagent D） 微升

專性液（Reagent E） 微升

保存緩沖液（Reagent A）在室溫下；其余的保存在－20℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent B）、底物液（Reagent

C）和專性液（Reagent E）

避免光照；有效保證 3 月

用戶自備

1.5 毫升離心管：用于反應(yīng)液配制的容器

（微型）臺式離心機(jī)：用于樣品制備

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

200 微升 1 厘米光徑比色皿或 96 孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

實驗步驟

一、 樣品準(zhǔn)備

選擇一：血漿樣品

1． 準(zhǔn)備好肝素或 ACD 抗凝管（注意：避免使用 EDTA 抗凝管）

2． 抽取 1 毫升血液，置于抗凝管里

3． 放進(jìn) 4℃微型臺式離心機(jī)離心 10 分鐘，速度為 700g（或 3000RPM，例如 eppendorf 5415）

4． 小心移取上層黃色液體到新的 1.5 毫升離心管――此為血漿成分（注意：避免觸碰白色液體層）

5． 移取 10 微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

6． 即刻置于冰槽里備用或放進(jìn)－70℃冰箱里保存

選擇二：血清樣品

1． 準(zhǔn)備好不含抗凝劑的儲存管

2． 抽取 1 毫升血液，置于儲存管里

3． 室溫下，靜置 30 分鐘，直至血液凝結(jié)

4． 放進(jìn) 4℃微型臺式離心機(jī)離心 15 分鐘，速度為 2000g（或 5000RPM，例如 eppendorf 5415）

5． 小心移取上層黃色液體到新的 1.5 毫升離心管――此為血清成分（注意：避免觸碰白色液體層）

6． 移取 10 微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

7． 即刻置于冰槽里備用或放進(jìn)－70℃冰箱里保存

選擇三：尿液/腦脊液/唾液/精液樣品

1． 準(zhǔn)備好 1.5 毫升離心管

2． 移取 1 毫升液體到離心管

3． 放進(jìn) 4℃微型臺式離心機(jī)離心 10 分鐘，速度為 700g（或 3000RPM，例如 eppendorf 5415）

4． 小心移取上清液到新的 1.5 毫升離心管

5． 移取 10 微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

6． 即刻置于冰槽里備用或放進(jìn)－70℃冰箱里保存

1． 開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為 37℃）：波長 412nm，間隔 1 分鐘，讀數(shù) 15 次（共 15 分鐘），并置

零

2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；反應(yīng)液（Reagent B）和底物液（Reagent C）避免光照

3． 緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度

三、 （選擇步驟）樣品背景對照測定

1． 移取 xx 微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升反應(yīng)液（Reagent B）

3． 加入 xx 微升陰性液（Reagent D）

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在 37℃溫度下孵育 3 分鐘

6． 加入 10 微升待測樣品（100 微克總蛋白）（注意：樣品須清澈）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照（15 分鐘讀數(shù)－0 分鐘讀數(shù)）

四、 樣品總活性測定

1． 移取 xx 微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升反應(yīng)液（Reagent B）

3． 加入 xx 微升底物液（Reagent C）

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在 37℃溫度下孵育 3 分鐘

6． 加入 10 微升待測樣品（100 微克總蛋白）（注意：樣品須清澈）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（15 分鐘讀數(shù)－0 分鐘讀數(shù)）

五、樣品非特異活性測定

檢測開始前，移取 10 微升待測樣品（100 微克總蛋白）到新的 1.5 毫升離心管，加入 xx 微升專性液（Reagent

E），混勻后，在 37℃溫度下孵育 30 分鐘，然后置于冰槽里備用

1． 移取 xx 微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升反應(yīng)液（Reagent B）

3． 加入 xx 微升底物液（Reagent C）

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在 37℃溫度下孵育 3 分鐘

6． 加入 20 微升上述預(yù)處理的待測樣品

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（15 分鐘讀數(shù)－0 分鐘讀數(shù)）

六、計算樣品活性

  (一） 樣品活性（總活性或非特異活性）

（二） 樣品特異活性

樣品總活性－樣品非特異活性＝樣品特異活性

七、 酶標(biāo)儀測定

（一） 樣品總活性檢測

1． 在 96 孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：樣品背景（選擇步驟）和樣品活性

2． 分別移取 xx 微升緩沖液（Reagent A）到 96 孔板中的所有孔里

3． 分別加入 xx 微升反應(yīng)液（Reagent B）到所有孔里

4． 加入 xx 微升底物液（Reagent C）到樣品活性孔里

5． 加入 xx 微升陰性液（Reagent D）到樣品背景孔里

6． 輕輕搖動 96 孔板

7． 在 37℃溫度下孵育 3 分鐘

8． 分別加入 5 微升待測樣品（50 微克總蛋白）到所有孔里（注意：樣品須清澈）

9． 輕輕搖動 96 孔板

10．即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測：0 分鐘讀數(shù)和 15 分鐘讀數(shù)

11．活性計算：

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 樣品稀釋倍數(shù) X 0.1（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 13.6（毫

摩爾吸光系數(shù)）X 0.3（光徑距離；厘米）X 15（反應(yīng)時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/

毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾含硫多肽底物/分鐘

（二） 樣品非特異性活性檢測

檢測開始前，移取 5 微升待測樣品（50 微克總蛋白）到新的 1.5 毫升離心管，加入 xx 微升專性液（Reagent

E），混勻后，在 37℃溫度下孵育 30 分鐘，然后置于冰槽里備用

1． 在 96 孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：待測樣品

2． 移取 xx 微升緩沖液（Reagent A）到 96 孔板里

3． 加入 xx 微升反應(yīng)液（Reagent B）

4． 加入 xx 微升底物液（Reagent C）

5． 輕輕搖動 96 孔板

6． 在 37℃溫度下孵育 3 分鐘

7． 加入 10 微升上述預(yù)處理的待測樣品

8． 輕輕搖動 96 孔板

9． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測：0 分鐘讀數(shù)和 15 分鐘讀數(shù)

10．活性計算：

5

（三） 樣品特異性活性計算

注意事項

1． 本產(chǎn)品為 20 次（10 個樣本；比色皿）和 50 次（25 個樣本；96 孔板）操作，包括背景對照

2． 操作時，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需 1 次

4． 專性液（Reagent E）嚴(yán)禁反復(fù)凍融；有效期為 3 個月

5． 樣品須澄清，至關(guān)重要

6． 樣品準(zhǔn)備要點如下：

a) 樣品中避免使用 EDTA、EGTA 等二價陽離子鰲和劑

b) 樣品中避免使用硫醇抑制劑（THIOL INHIBITOR）

c) 如果樣品中的基質(zhì)金屬蛋白酶活性很低，可以使用活化劑（建議使用膠原酶潛酶活化劑（APMA）

－12197）

7． 如果試劑室溫下不能融化，可以置于手心焐熱融化即可

8． 建議使用比色皿測定

9． 樣品須澄清，至關(guān)重要

10．加樣后 3 秒內(nèi)比色測定

11．測定值由低到高變化；測定可持續(xù) 15 分鐘

12．比色測定后，比色皿須清洗

13．樣本測定 15 分鐘讀數(shù)高于 0 分鐘讀數(shù)表明具有酶活性

14．待測樣本為酶粗提樣品，其蛋白濃度為 20 微克/10 微升；待測樣本為體液懸液，其蛋白濃度為 100 微

克/10 微升（本公司提供 Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒 30030.1）

15．如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度

16．如果檢測基質(zhì)金屬蛋白酶 14 抑制劑，在加入底物液（Reagent C）前，37℃下孵育 30 分鐘

17．可以檢測部分或純化酶樣品中基質(zhì)金屬蛋白酶 14，則可以省去非特異活性檢測步驟

18．基質(zhì)金屬蛋白酶 14 酶活性單位濃度定義：在 37℃溫度下，pH 6.0 的情況下，每單位 NSC 405020 敏感

性酶在單位時間內(nèi)（每分鐘）水解 1 微摩爾的含硫多肽底物

19．本公司提供系列基質(zhì)金屬蛋白酶檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感