細(xì)胞 GSK3α激酶活性光譜法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

主要用途

細(xì)胞 GSK3α激酶活性光譜法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)多肽底物，在 GSK3β抑制劑的存在下，受到GSK3α磷酸化后，進(jìn)而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，測(cè)定產(chǎn)生 ADP 過(guò)程中，伴隨的還原型腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)， 即采用光譜法測(cè)定其氧化后峰值的變化，以分析細(xì)胞裂解樣品中 GSK3α特異活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體）、部分或純化酶樣品中 GSK3α激酶的定量檢測(cè)，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

技術(shù)背景

糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3；GSK3；EC 2.7.11.26）屬于激酶（serine/threonine protein kinase）家屬成員之一。其目標(biāo)蛋白為糖原合成酶和活化T細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated Tlymphocytes；NFAT），進(jìn)行磷酸化后，抑制其功能，同時(shí)調(diào)控細(xì)胞對(duì)DNA損傷的反應(yīng)、生物發(fā)育的組織排列（tissue patterning）、蛋白合成、細(xì)胞分化和繁殖等。糖原合成酶激酶3從酵母到人體高度進(jìn)化保留，果蠅中GSK3同源蛋白為Shaggy（Zeste White 3），在Wnt信號(hào)通路中磷酸化β-catenin，導(dǎo)致后者泛素化后降解，防止β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核激活轉(zhuǎn)錄因子。糖原合成酶激酶3本身受到胰島素、生長(zhǎng)因子、蛋白激酶B（proteinkinase B）/v-akt鼠源胸腺瘤病毒腫瘤基因同源體（akt）調(diào)控。糖原合成酶激酶3分成兩種異構(gòu)體：糖原合成酶激酶3α和β，其結(jié)構(gòu)相似，功能不同。糖原合成酶激酶3α有一段較長(zhǎng)且富含（Glycine-rich）的N端。糖原合成酶激酶3α與β-類(lèi)淀粉物-40/42多肽（beta-amyloid-40/ 42 peptides）大量產(chǎn)生有關(guān)。其功能異常將導(dǎo)致阿茲罕默綜合征等疾病。其磷酸化目標(biāo)序列為RRAAEELDSRAGSPQL?；诘孜颮RAAEELDSRAGSPQL，在ATP和GSK3β抑制劑噻二唑烷酮-8（thiadiazolidinone-8；TDZD-8）的存在下，受到GSK3α激酶的磷酸化，獲得產(chǎn)物磷酸化多肽，進(jìn)而通過(guò)丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的變化（340nm），來(lái)定量分析糖原合成酶激酶3α的特異活性。其反應(yīng)方式為： 產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A） 毫升

裂解液（Reagent B） 毫升

緩沖液（Reagent C） 毫升

酶促液（Reagent D） 微升

反應(yīng)液（Reagent E） 微升

底物液（Reagent F） 微升

陰性液（Reagent G） 微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 1 份

保存方式

保存清理液（Reagent A）在 4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月

用戶自備

GSK3α激酶：用于抑制劑篩選

1.5 毫升離心管：用于樣品保存的容器

15 毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于貼壁細(xì)胞脫離

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于組織預(yù)處理

比色皿或酶標(biāo)板：用于光譜分析操作的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于樣品光譜分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 待測(cè)樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好 25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或 60mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1 至 5 X 106細(xì)胞）

2． 小心加入 xx 毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：避免使用消化）

5． 加入 xx 毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

6． 移入到預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始）

7． 放進(jìn) 4℃臺(tái)式離心機(jī)離心 5 分鐘，速度為 300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入 xx 微升裂解液（Reagent B），充分混勻

10．轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的 1.5 毫升離心管

11．強(qiáng)力渦旋震蕩 15 秒

12．置于冰槽里孵育 30 分鐘

13．放進(jìn) 4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心 5 分鐘，速度為 16000g（或 13000RPM，例如 eppendorf 5415）

14．小心移取 500 微升上清液到新的預(yù)冷的 1.5 毫升離心管

15．移取 10 微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

16．即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測(cè)定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解懸液等），置于冰槽里

2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為 30℃）：波長(zhǎng)為 340nm，間隔 1 分鐘，讀數(shù) 6 次（共 5 分鐘），并置零

3． 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

三、 背景對(duì)照測(cè)定

1． 移取 xx 微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升酶促液（Reagent D）

3． 加入 xx 微升反應(yīng)液（Reagent E）

4． 加入 xx 微升底物液（Reagent F）

5． 放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里靜置 3 分鐘

6． 加入 xx 微升陰性液（Reagent G）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：340 波長(zhǎng)讀數(shù) 0 分鐘 －340 波長(zhǎng)讀數(shù) 5 分鐘

四、 樣品測(cè)定

1． 移取 xx 微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升酶促液（Reagent D）

3． 加入 xx 微升反應(yīng)液（Reagent E）

4． 加入 xx 微升底物液（Reagent F）

5． 放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里靜置 3 分鐘

6． 加入 5 微升待測(cè)樣品（注意：50 微克細(xì)胞裂解蛋白；樣品須溶解）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品總活性讀數(shù)：340 波長(zhǎng)讀數(shù) 0 分鐘 －340 波長(zhǎng)讀數(shù) 5 分鐘

五、 計(jì)算樣品活性

六、 酶標(biāo)板測(cè)定

1． 在 96 孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品

2． 分別移取 xx 微升緩沖液（Reagent C）到 96 孔板中

3． 分別加入 xx 微升酶促液（Reagent D）

4． 分別加入 xx 微升反應(yīng)液（Reagent E）

5． 分別加入 xx 微升底物液（Reagent F）

6． 輕輕搖動(dòng) 96 孔酶標(biāo)板

7． 在 30℃溫度下孵育 3 分鐘

8． 分別加入 xx 微升陰性液（Reagent G）或待測(cè)樣品（50 微克細(xì)胞裂解懸液蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）

9． 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板

10．即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0 分鐘讀數(shù)和 5 分鐘讀數(shù)

11．活性計(jì)算：

七、抑制劑篩選

1． 在 96 孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景、活性和待測(cè)抑制劑樣品

2． 按下表加入試劑，進(jìn)行樣品預(yù)處理

內(nèi)容物 空背景對(duì)照 樣本背景 酶活性 待測(cè)抑制劑酶活性緩沖液（ReagentC）xx 微升 xx 微升 xx 微升 xx 微升陰性液（ReagentG）

xx 微升 xx 微升 xx 微升 ——

待測(cè)抑制劑 —— xx 微升 ―― xx 微升

用戶自備的純化酶 —— —— xx 微升（1 毫單位） xx 微升（1 毫單位）

96 孔板每孔總量 空背景對(duì)照孔

（xx 微升）

樣本背景孔

（xx 微升）

活性孔

（xx 微升）

待測(cè)抑制劑樣品孔

（xx 微升）

輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板，混勻，放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里孵育 30 分鐘。然后進(jìn)行下列操作

3． 分別移取 xx 微升緩沖液（Reagent C）到新的 96 孔板的所有孔里

4． 分別加入 xx 微升酶促液（Reagent D）

5． 分別加入 xx 微升反應(yīng)液（Reagent E）

6． 分別加入 xx 微升底物液（Reagent F）

7． 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板

8． 在 30℃溫度下孵育 3 分鐘

9． 加入 20 微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品

10．即刻放進(jìn) 30℃酶標(biāo)儀檢測(cè)：測(cè)讀 30 分鐘

11．抑制活性計(jì)算： 注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為 20 次操作，包括背景操作

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需 1 次

4． 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液

5． 樣品須澄清，至關(guān)重要

6． 加入樣品啟動(dòng)反應(yīng)后 3 秒內(nèi)即刻光譜測(cè)定

7． 測(cè)定值由高到低變化；測(cè)定可持續(xù) 30 分鐘

8． 光譜測(cè)定后，比色皿須清洗

9． 樣本測(cè)定 0 分鐘讀數(shù)高于 5 分鐘讀數(shù)表明具有酶活性

10．建議待測(cè)樣本蛋白濃度為 50 微克/5 微升（本公司提供 Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

11．如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度

12．可以使用 GSK3α抑制劑 Aloisine A 作為抑制劑對(duì)照或陰性對(duì)照

13．糖原合成酶激酶 3α活性單位濃度定義：在 30℃溫度下，pH 7.5 條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化 1 微摩爾還原型腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個(gè)活性單位

14．本公司提供系列蛋白激酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感