軟瓊脂細胞克隆試劑盒特別適用于動物或人體轉(zhuǎn)化型體細胞和轉(zhuǎn)染后細胞的生長。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，性能穩(wěn)定，操作簡便，重復(fù)一致。

實驗步驟如下：

實驗開始前，將4℃冰箱里的試劑盒中的所有試劑溶液放進37℃恒溫水浴里預(yù)熱。然后進行下列操作。

一、 細胞培養(yǎng)瓶（25cm2）操作

1． 將克隆液（Reagent A）置于微波爐里加熱溶化（注意：避免溢出）

2． 放進50℃恒溫水浴

3． 移出15毫升預(yù)熱的高養(yǎng)液（Reagent B）到50毫升錐形離心管

4． 移出15毫升克隆液（Reagent A）到50毫升錐形離心管

5． 輕度渦旋震蕩或用手搖動錐形離心管，充分混勻

6． 最快速度分別移入3毫升（每個3毫升）到10個25cm2細胞培養(yǎng)瓶

7． 用手輕輕抖動，鋪滿整個底面，避免氣泡產(chǎn)生

8． 置于室溫下至少2小時，使膠體凝固

9． 準備1瓶25cm2或75cm2細胞培養(yǎng)瓶的待測細胞，清洗，脫落，計數(shù)

10． 移出1毫升（總量為2500個細胞）到15毫升錐形離心管

11． 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為300g

12． 小心抽去上清液

13． 加入2.25毫升預(yù)熱的中養(yǎng)液（Reagent C），用槍頭上下輕柔抽吸混勻（注意：用戶可以加入細胞因子、篩選藥物等）

14． 加入750微升克隆液（Reagent A），用槍頭上下輕柔抽吸混勻

15． 最快速度全部移入到1個25cm2細胞培養(yǎng)瓶里，置于已凝固的膠體上面

16． 用手輕輕抖動，鋪滿整個底面，避免氣泡產(chǎn)生

17． 置于室溫下至少2小時，使膠體凝固

18． 放進37℃二氧化碳細胞培養(yǎng)箱孵育

19． 次日，輕輕加入3毫升低養(yǎng)液（Reagent D）在膠體上面（注意：用戶可以加入細胞因子、篩選藥物等）

20． 1周后，再次加入3毫升低養(yǎng)液（Reagent D）在膠體上面

21． 2周后，在倒置顯微鏡下觀察細胞：細胞集落形成能力和效率（Clonogenicity/Efficiency），包括細胞集落數(shù)目、細胞集落大小，以及貼壁非依賴型生長等

22． （選擇步驟）小心抽去低養(yǎng)液（Reagent D）

23． （選擇步驟）用細胞刮脫棒小心刮落含有細胞集落的中養(yǎng)層

24． （選擇步驟）用1000微升槍頭（翦去頂端部分）吸出細胞集落

25． （選擇步驟）加入到25cm2細胞培養(yǎng)瓶

26． （選擇步驟）加入3毫升用戶自備的*細胞培養(yǎng)液

27． （選擇步驟）用5毫升移液管抽吸，充分打碎細胞集落

28． （選擇步驟）放進37℃二氧化碳細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育

二、細胞培養(yǎng)板（12孔板）操作

1． 將克隆液（Reagent A）置于微波爐里加熱溶化（注意：避免溢出）

2． 放進50℃恒溫水浴

3． 移出10毫升預(yù)熱的高養(yǎng)液（Reagent B）到50毫升錐形離心管

4． 移出10毫升克隆液（Reagent A）到50毫升錐形離心管

5． 輕度渦旋震蕩或用手搖動錐形離心管，充分混勻

6． 最快速度分別移入1.5毫升（每孔1.5毫升）到12孔細胞培養(yǎng)板的每個孔里

7． 用手輕輕抖動，鋪滿整個底面，避免氣泡產(chǎn)生

8． 置于室溫下至少2小時，使膠體凝固

9． 準備1瓶25cm2或75cm2細胞培養(yǎng)瓶的待測細胞，清洗，脫落，計數(shù)

10． 移出1毫升（總量為2500個細胞）到15毫升錐形離心管

11． 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為300g

12． 小心抽去上清液

13． 加入1.125毫升預(yù)熱的中養(yǎng)液（Reagent C），用槍頭上下輕柔抽吸混勻（注意：用戶可以加入細胞因子、篩選藥物等）

14． 加入375微升克隆液（Reagent A），用槍頭上下輕柔抽吸混勻

15． 最快速度全部移入到12孔細胞培養(yǎng)板的1個孔里，置于已凝固的膠體上面

16． 用手輕輕抖動，鋪滿整個底面，避免氣泡產(chǎn)生

17． 置于室溫下至少2小時，使膠體凝固

18． 放進37℃二氧化碳細胞培養(yǎng)箱孵育

19． 次日，輕輕加入500微升低養(yǎng)液（Reagent D）在膠體上面（注意：用戶可以加入細胞因子、篩選藥物等）

20． 1周后，再次加入500微升低養(yǎng)液（Reagent D）在膠體上面

21． 2周后，在倒置顯微鏡下觀察細胞：細胞集落形成能力和效率（Clonogenicity/Efficiency），包括細胞集落數(shù)目、細胞集落大小，以及貼壁非依賴型生長等

22． （選擇步驟）小心抽去低養(yǎng)液（Reagent D）

23． （選擇步驟）用細胞刮脫棒小心刮落含有細胞集落的中養(yǎng)層

24． （選擇步驟）用1000微升槍頭（翦去頂端部分）吸出細胞集落

25． （選擇步驟）加入到25cm2細胞培養(yǎng)瓶或6孔細胞培養(yǎng)板的1個孔里

26． （選擇步驟）加入3毫升用戶自備的*細胞培養(yǎng)液

27． （選擇步驟）用5毫升移液管抽吸，充分打碎細胞集落

28． （選擇步驟）放進37℃二氧化碳細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育