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上海永葉生物科技有限公司

抗原修復方法

時間:2013-7-22閱讀:348
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盡管固定對于組織形態(tài)的保留是*的,但這一過程對IHC/ICC檢測也有不良影響。固定可能會改變蛋白的生化特性,如目的表位被掩蓋,或不再與一抗結(jié)合。表位的掩蓋可能是由氨基酸與表位的交聯(lián)、表位附近無關(guān)肽段的交聯(lián)、表位構(gòu)象的改變或抗原靜電荷的改變引起的。抗原修復指的是逆轉(zhuǎn)表位掩蓋和恢復表位-抗體結(jié)合的技術(shù)。

抗原修復技術(shù)

抗原修復的需要取決于多個變量,包括但不限于,目的抗原、所使用的抗體、組織類型,以及固定方法和持續(xù)時間。多克隆抗體能識別多個表位,因此即使不進行抗原修復,它們也比單克隆抗體更有可能檢測到特定抗原。

目前有多種技術(shù)可恢復表位的免疫反應(yīng)性。簡單的方法有改變抗體稀釋液的pH或陽離子濃度,這可能影響抗體與表位的親和力。對于部分掩蓋的表位,在開始抗原修復之前可以先試試改變一抗的孵育條件。不過,這一步也需要抗體濃度、孵育時間和溫度的進一步優(yōu)化。在討論抗體修復方法時,技術(shù)通常分為兩大類,蛋白酶誘導的表位修復(PIER)和熱誘導的表位修復(HIER)。一旦優(yōu)化好,抗原修復的影響可能是明顯的。

蛋白酶誘導的表位修復(PIER)

在PIER方法中,蛋白酶K、*和*等都曾成功恢復抗體與表位的結(jié)合。人們認為作用機制是切割了可能遮蓋表位的肽段。PIER的缺點在于恢復免疫反應(yīng)性的成功率低,且有可能破壞組織形態(tài)和目的抗原。

熱誘導的表位修復(HIER)

HIER被認為能逆轉(zhuǎn)一些交聯(lián),并實現(xiàn)表位二級或三級結(jié)構(gòu)的重建。每種組織、固定方法和待研究抗原的實驗方案必須經(jīng)過優(yōu)化。總的來說,HIER的成功率比PIER要高得多。HIER可利用微波爐、高壓鍋、蒸屜、高壓滅菌鍋或水浴開展。在HIER實驗中,微波爐是越來越流行的設(shè)備。這些方案大多加熱5分鐘,然后更換緩沖液。對于所有HIER方法,在開始IHC/ICC孵育之前必須讓玻片冷卻。HIER對時間、溫度、緩沖液和pH特別敏感,*方法必須根據(jù)經(jīng)驗確定。生物通 www.ebiotrade.com

優(yōu)化與限制

抗原修復可能需要加強樣品與玻片或蓋玻片的附著。此外,此技術(shù)對于冰凍組織切片和酒精固定切片通常過于劇烈。對于每種設(shè)備,時間、溫度和pH必須經(jīng)過優(yōu)化(如92-95 °C水浴中的5-10分鐘,相對120 °C高壓鍋中的1-5分鐘)。為了優(yōu)化抗原修復,必須開展初步研究,使用時間、溫度和pH的各種組合。在使用抗原修復方法時,應(yīng)始終考慮到染色假象的可能性。實驗應(yīng)當包含對照,以證明特異的抗體結(jié)合,因為染色常受到實驗中多個變量的影響。

R&D Systems提供了一些試劑,可改善組織抗原檢測,并增強免疫反應(yīng)性。在初次優(yōu)化時,研究人員可比較經(jīng)中性pH 7.0通用抗體修復液(貨號CTS015)處理的樣品和未經(jīng)過抗原修復的同一組織樣品。之后可能需要使用酸性或堿性的抗原修復液,這取決于組織。他們發(fā)現(xiàn),堿性抗原修復液(貨號CTS013)的處理通常很成功。同時也提供酸性(貨號CTS014)以及試用裝(貨號CTS016)的抗原修復液。與中性溶液相比,酸性和堿性抗原修復液更可能影響組織形態(tài)。

 

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