[器材和試劑]
● Tag DNA聚合酶（Boehringer、Promega或者Stratagelle）
● 10×Tdg緩沖液 （BOehringer、 Promega或者Stratagene）
● dATP、 dGTP、 dCTP 各 2mm01/L （AmershamDiOSCiences）
● dTTP-dUTP混合物：2mmol/L-0mm01/L， 1．5mmol/L-0．5mm01/L， 1mmol/L1mmol/L， 0．5mmol/L1．5mm01/L，0mm01/L2mmol/L（Amersham Biosciences）
● 上游和下游引物（各25pm01）
● 模板DNA樣品（各1～50ng）
● QIAquick離心柱（Qiagen）或者QIAEXⅡ膠抽提試劑盒（Qiagen）
● 來(lái)自大腸桿菌的內(nèi)切酶V（Trevigen）
● 10X內(nèi)切酶V緩沖液（Trevigen）
[方法]
A.含有*的重組模板的制備
1．混合5/ll 10XTaq緩沖液，均為0．2mmol/L的dATP、dGTP和dCTP以及0．2mmol/L dTTP-dUTP混合物， l～50ng模板DNA， 上下游引物各25pm01和1．25U Tdq DNA聚合酶?？傮w積為50ul。
2．95℃加熱PCR混合物1分鐘，接下來(lái)進(jìn)行25～30次如下循環(huán)：94℃孵育30秒，55℃孵育30秒，然后72℃30秒。zui后72℃孵育7分鐘。
3．通過(guò)含有溴化乙錠（0．5Hg～1）的1％（w/v）瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段。在紫外燈下觀察DNA并切下位于預(yù)定大小區(qū)域的DNA。
4．純化片段（例如使用QIAspin柱或QIAEXⅡ試劑盒）并用27ftl超純水洗脫。
B．重組模板的內(nèi)切酶V消化
1．加3ul 10X內(nèi)切酶緩沖液和1U內(nèi)切酶V。
2．溶液在37℃孵育12小時(shí)，接著95℃加熱10分鐘。
3．通過(guò)含有溴化乙錠（0．5/ug～1）的2％（w/v）瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段。在紫外燈下觀察DNA并切下位于預(yù)定大小區(qū)域的DNA。
4．純化片段（例如使用QIAspin柱或QIAEXⅡ試劑盒）并且用30ul超純水洗脫。使用3～10ul純化的片段來(lái)繼續(xù)進(jìn)行合成反應(yīng)
