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由于鑄膠溶液非常重要且多樣,因此下面把所有電泳溶液的配置方法仔細(xì)列出,希望能在每一個(gè)實(shí)驗(yàn)室成功進(jìn)行電泳;但使用者一定要明白其配制的原理與各種濃度的算法,而不是只會(huì)依配方泡制而已。
A液:丙烯酰胺液 (total 30%, cross-linking 2.6%)
丙烯酰胺 (acrylamide, Merck 10784) 29.2 gm
Bis 架橋劑 (Sigma M-7256) 0.8 gm
加純水溶解至 100 mL A 液也有商品已經(jīng)配制好溶液者,若實(shí)驗(yàn)課采用Ameresco 的40%溶液(T40%, C2.6%),配法有些變動(dòng),請(qǐng)?zhí)貏e注意;Bis 是N’,N’-methylene-bis(acrylamide) 的簡(jiǎn)稱,可看成是兩分子acrylamide連在一起,作為架橋物,以便成為立體的膠體; 以30℃加熱助溶,有不溶物質(zhì)須過(guò)濾去除;若丙烯酰胺品質(zhì)不佳或久貯,在溶成100 mL 后,可加一些離子交換樹(shù)脂Dowex MR-3 攪拌,放過(guò)夜并過(guò)濾后置4℃保存; 注意acrylamide 溶液有神經(jīng)毒性! 不要直接接觸,凝膠后毒性消失,但膠體無(wú)法達(dá)到百分的百凝膠,因此也要小心處理膠片。
B液:分離膠體緩沖液 (running或separation buffer)
Tris (Tris base, 1.5 M) 90.8 gm
TEMED (Sigma T-8133) 1.8 mL
溶入300 mL 水,以l M HCl 119 mL 調(diào)pH 到8.8 再加水至500 mL TEMED (tetramethylenediamine) 可幫助自由基傳導(dǎo),是催化劑。
C液:焦集膠體緩沖液 (stacking buffer)
Tris (Tris base, 0.5 M) 6.0 gm
TEMED (Sigma T-8133) 0.4 mL
溶入40 mL 水,加l M HCl 47 mL 調(diào)pH 至6.8,加水至 100 mL
D液:電泳緩沖液 (chamber buffer),5×溶液
Tris (Tris base, 0.05 M×5) 30.3 gm
甘胺酸 (glycine, 0.38 M×5) 142.6 gm
溶入800 mL 水,pH 調(diào)到8.3 后再加水至1 L 使用時(shí)稀釋5 倍 甘胺酸是電泳緩沖液的主要分子,是造成電泳樣本焦集的原因;近來(lái)多改用boric acid (下面F 液),應(yīng)自行試用何者為佳。
E 液:SDS-PAGE 樣品溶液,2×溶液
Tris (Tris base, 125 mM×2) 3.0 gm
80 Methods in Biotechnology Vol 1
EDTA·2Na (2 mM×2) 14.8 mg
SDS (2%×2) 4.0 gm
β-mercaptoethanol (5%×2, Sigma M-6250) 10.0 mL
加水80 mL 溶的,pH 調(diào)到6.8,再加水至 100 mL
F 液:通用電泳緩沖液,5×溶液
Tris (Tris base, 90 mM×5) 54.5 gm
Boric acid (80 mM×5) 24.8 gm
EDTA·2Na (2.5 mM×5) 4.7 gm
加水800 mL 溶的,pH 調(diào)到8.4,再加水至 1,000 mL 使用時(shí)稀釋5 倍。本溶液在disc-或SDS-PAGE 均通用,后者要加SDS 至0.1%。
SDS水溶液 (10%) SDS 粉末很輕,揚(yáng)起來(lái)很容易吸入肺部,在肺泡溶解產(chǎn)生界面活性的作用,使得肺部細(xì)胞無(wú)法進(jìn)行氧分子交換,非常危險(xiǎn)。
APS溶液 (過(guò)硫酸銨, 5%) :
APS (ammonium persulfate, Bio-Rad 161-0700) 50 mg溶于l mL 水中,使用前才配制好,隔日不可再用。 APS是自由基 (free radical) 的產(chǎn)生者,可誘發(fā)acrylamide的連鎖聚合反應(yīng),因此是整個(gè)凝膠反應(yīng)的起始者。冬天可增至10%,夏天可減至2%。注意APS 固體很容易分解,應(yīng)密蓋貯于干燥皿;鑄膠無(wú)法凝結(jié)的毛病,多出自APS 的質(zhì)量不良。
追蹤染料 (tracking dye) :
Bromophenol blue (Sigma B-6896) l mg溶于5 mL 水,再加5 mL 甘油均勻混合。 加在樣本蛋白質(zhì)中,可增加樣本密度并賦予顏色,方便目視以注入膠片的樣本槽。
染色液 (CBR染液) :
Coomassie brilliant blue R-250 (CBR, Sigma B-0149) 1 gm溶于250 mL 水后,再加入250 mL 甲醇及50 mL 醋酸混合均勻,充分溶解CBR,若有不溶物質(zhì),則須過(guò)濾后裝瓶密蓋。 Coomassie blue 有許多種不同的相關(guān)化合物,不要取用作為蛋白質(zhì)定量用的Coomassie blue G-250 來(lái)染色,效果稍差。
脫色液 (20%甲醇及10%醋酸):
在一1 L 量筒中,先到入200 mL 甲醇及100 mL 醋酸,再加水至1 L,混合均勻后密蓋備用。 甲醇濃度可提高到30%,則可增加脫色速度,但小心脫色過(guò)度。
標(biāo)準(zhǔn)分子量組合︰
Pharmacia 有高低兩種分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)組合,SDS-PAGE 使用:
高分子量組: Thyroglobulin (669kD, 330 kD), ferritin (440 kD, 220 kD, 18.5 kD),catalase (232 kD, 36 kD), albumin (67 kD)
低分子量組: Phosphorylase (94 kD), albumin (67 kD), ovalbumin (43 kD), carbonic anhydrase (30 kD), trypsin inhibitor (20 kD), lactalbumin (14.4 kD)
另外Novel 有預(yù)先染好藍(lán)色的SeeBlue (LC5625) 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)組合,除了一般電泳外,更可用在轉(zhuǎn)印,檢查轉(zhuǎn)印是否成功:
SeeBlue: Myosin (250 kD), albumin (98 kD), glutamic dehydrogenase (64 kD),
alcohol dehydrogenase (50 kD), carbonic anhydrase (36 kD), myoglobin (30 kD),
lysozyme (16 kD), aprotinin (6 kD), insulin B chain (4 kD
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