. 范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的檢驗(yàn)方法。

本標(biāo)準(zhǔn)*法適用于食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的定性檢驗(yàn)；第二法適用于單核細(xì)胞

增生李斯特氏菌含量較高的食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的計(jì)數(shù)；第三法適用于單核細(xì)胞增

生李斯特氏菌含量較低而雜菌含量較高的食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的計(jì)數(shù)。

2. 設(shè)備和材料

注: 除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：

2.1  冰箱：2 ℃～5 ℃。

2.2  恒溫培養(yǎng)箱：30 ℃±1 ℃、36 ℃±1 ℃、20 ℃±1 ℃。

2.3  均質(zhì)器。

2.4  顯微鏡：10倍～100倍。

2.5  電子天平：感量0.1 g 。

2.6  錐形瓶：100 mL、500 mL。

2.7  無(wú)菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸頭。

2.8  無(wú)菌平皿：直徑90 mm。

2.9  無(wú)菌試管：16 mm×160 mm。

2.10  離心管：30 mm×100 mm。

2.11  *：1 mL。

2.12  單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes ATCC19111或CMCC54004）、英諾克

李斯特氏菌（Listeria innocua ATCC33090）、伊氏李斯特氏菌（Listeria ivanovii ATCC19119）、斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri ATCC35967）或具相同效果的標(biāo)準(zhǔn)株。

2.13  *（Staphylococcus aureus ATCC25923或其他產(chǎn)β-溶血環(huán)金葡菌）。

2.14  馬紅球菌（Rhodococcus equi ATCC6939或NCTC1621）。

2.15  小白鼠：ICR體重18 g～22 g。 

2.16  全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)。

3  培養(yǎng)基和試劑

3.1  含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯（TSB-YE）：見(jiàn)附錄A中A.1。

3.2  含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂（TSA-YE）：見(jiàn)附錄A中A.2。

3.3  李氏增菌肉湯LB（LB1，LB2）：見(jiàn)附錄A中A.3。

3.4  1%鹽酸吖啶黃（acriflavine HCl）溶液：見(jiàn)附錄A中A.3.2.1、A.3.2.2。

3.5  1%萘啶酮酸鈉鹽（naladixic acid）溶液：見(jiàn)附錄A中A.3.2.1、A.3.2.2。

3.6  PALCAM瓊脂：見(jiàn)附錄A中A.4。

3.7  ALOA (Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti)瓊脂：見(jiàn)附錄A中A.5。

3.8  革蘭氏染液：見(jiàn)附錄A中A.6。

3.9  SIM動(dòng)力培養(yǎng)基：見(jiàn)附錄A中A.7。

3.10  緩沖葡萄糖蛋白胨水[甲基紅（MR）和V-P試驗(yàn)用]：見(jiàn)附錄A中A.8。

3.11  5%～8%羊血瓊脂：見(jiàn)附錄A中A.9。 

3.12  糖發(fā)酵管：見(jiàn)附錄A中A.10。

3.13  過(guò)氧化氫試劑：見(jiàn)附錄A中A.11。

3.14  李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基。

3.15  生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)。

3.16  緩沖蛋白凍水：見(jiàn)附錄A中A.12

*法 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)

4.  檢驗(yàn)程序

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖1。

5  操作步驟

5.1  增菌

以無(wú)菌操作取樣品25 g（mL）加入到含有225 mL LB1增菌液的均質(zhì)袋中，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1 min～2 min；或放入盛有225 mL LB1增菌液的均質(zhì)杯中，以8000 r/min～10000 r/min均質(zhì)1 min～2 min。于30 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h±2 h，移取0.1 mL，轉(zhuǎn)種于10 mL LB2增菌液內(nèi)，于30 ℃±1 ℃培養(yǎng)18 h～24 h。

5.2  分離

取LB2 二次增菌液劃線接種于李斯特氏菌顯色（或ALOA）平板和PALCAM瓊脂平板，于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h～48 h，觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落。典型菌落在ALOA瓊脂平板上為藍(lán)綠色菌落周圍有不透明暈圈；在PALCAM瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷；在李斯特氏菌顯色平板上的菌落特征，參照產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行判定。

     注： ALOA平板上的典型菌落為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌或伊氏李斯特氏菌；如果ALOA平板上菌落不典型，可繼續(xù)培養(yǎng)48 h，再觀察。部分菌株不產(chǎn)生透明暈圈。

5.3  初篩

自選擇性瓊脂平板上分別挑取3個(gè)～5個(gè)典型或可疑菌落，在TSA-YE平板上劃線純化, 于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18 h～24 h,分別接種在木糖、鼠李糖發(fā)酵管，于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h±2 h。選擇木糖陰性、鼠李糖陽(yáng)性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進(jìn)行鑒定。

5.4  鑒定

5.4.1 染色鏡檢：李斯特氏菌為革蘭氏陽(yáng)性短桿菌，大小為（0.4 μm～0.5 μm）×（0.5 μm～2.0 μm）；用生理鹽水制成菌懸液，在油鏡或相差顯微鏡下觀察，該菌出現(xiàn)輕微旋轉(zhuǎn)或翻滾樣的運(yùn)動(dòng)。

5.4.2 動(dòng)力試驗(yàn)：挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落穿刺半固體或SIM動(dòng)力培養(yǎng)基，于25℃～30℃培養(yǎng)48h，李斯特氏菌有動(dòng)力，在半固體或SIM培養(yǎng)基上方呈傘狀生長(zhǎng)，如傘狀生長(zhǎng)不明顯，可繼續(xù)培養(yǎng)5d,再觀察結(jié)果。

5.4.3 生化鑒定：挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落，進(jìn)行過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)，過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性反應(yīng)的菌落繼續(xù)進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)和MR-VP試驗(yàn)。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的主要生化特征見(jiàn)表1。

5.4.4 溶血試驗(yàn)：將新鮮的羊*底面劃分為20個(gè)～25個(gè)小格，挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落刺種到血平板上，每格刺種一個(gè)菌落，并刺種陽(yáng)性對(duì)照菌(單增李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌)和陰性對(duì)照菌(英諾克李斯特氏菌)，穿刺時(shí)盡量接近底部，但不要觸到底面，同時(shí)避免瓊脂破裂，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h～48 h，于明亮處觀察，單增李斯特氏菌呈現(xiàn)狹窄、清晰、明亮的溶血圈，斯氏李斯特氏菌在刺種點(diǎn)周圍產(chǎn)生弱的透明溶血圈，英諾克李斯特氏菌無(wú)溶血圈，伊氏李斯特氏菌產(chǎn)生寬的、輪廓清晰的β-溶血區(qū)域，若結(jié)果不明顯，可置4℃冰箱24 h～48 h再觀察。

    注：也可用劃線接種法。

5.4.5 協(xié)同溶血試驗(yàn) cAMP(可選項(xiàng)目)：在羊*上平行劃線接種*和馬紅球菌，挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落垂直劃線接種于平行線之間，垂直線兩端不要觸及平行線，距離1mm～2mm，同時(shí)接種單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌，于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h～48 h。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在靠近*處出現(xiàn)約2mm的β-溶血增強(qiáng)區(qū)域，斯氏李斯特氏菌也出現(xiàn)微弱的溶血增強(qiáng)區(qū)域，伊氏李斯特氏菌在靠近馬紅球菌處出現(xiàn)約5mm～10mm的“箭頭狀”β-溶血增強(qiáng)區(qū)域，英諾克李斯特氏菌不產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。若結(jié)果不明顯，可置4℃冰箱24 h～48 h再觀察。

5.5  可選擇生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)等對(duì)木糖陰性、鼠李糖陽(yáng)性的純培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定。

5.6  小鼠毒力試驗(yàn)（可選項(xiàng)目）

將符合上述特性的純培養(yǎng)物接種于TSB-YE中，于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h，4 000 r/min離心5 min，棄上清液，用無(wú)菌生理鹽水制備成濃度為1010 CFU/mL的菌懸液，取此菌懸液對(duì)3只～5只小鼠進(jìn)行腹腔注射，每只0.5 mL，同時(shí)觀察小鼠死亡情況。接種致病株的小鼠于2 d～5 d內(nèi)死亡。試驗(yàn)設(shè)單增李斯特氏菌致病株和滅菌生理鹽水對(duì)照組。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌對(duì)小鼠有致病性。

5.7  結(jié)果與報(bào)告

綜合以上生化試驗(yàn)和溶血試驗(yàn)的結(jié)果,報(bào)告25 g（mL）樣品中檢出或未檢出單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。