附錄B

五種致瀉大腸埃希氏菌PCR鑒定方法

B.1 試劑和材料

B.1.1  按照表B.1序列在基因合成公司合成引物。

B.1.2  1µL取菌環(huán)。

B.1.3  滅菌去離子水。

B.1.4  0.85%滅菌生理鹽水。

B.1.5  10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA， pH8.0 TE溶液：量取1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.0）5 mL、0.5 mol/L EDTA溶液（pH8.0）1 mL于500 mL燒杯中。加入約400 mL去離子水均勻混合，將溶液定容至500 mL，121 ℃高壓滅菌15 min，室溫保存。

B.1.6  1.5 mL Eppendorf管，8聯(lián)排管和8聯(lián)排蓋（平蓋/凸蓋）。

B.1.7  10×PCR反應(yīng)緩沖液，含840 mmoL Tris-HCl (pH 8.5)和500 mmoL KCl。

B.1.8   25 mmol/L MgCl2。

B.1.9   2.5 mmol/L dNTPs：dATP、dTTP、dGTP、dCTP每種濃度為2.5 mmol/L。

B.1.10  5 U/µL Taq酶。

B.1.11  陽(yáng)性對(duì)照品：包含12對(duì)引物擴(kuò)增的目標(biāo)DNA序列或者含有目標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)菌株。

B.1.12  50×TAE電泳緩沖液：稱量242 g Tris-HCl 和 37.2 g Na2EDTA·2H2O于1 L燒杯中，加入約800mL去離子水，充分?jǐn)嚢杈鶆?；加?7.1 mL的冰乙酸，充分溶解；用NaOH調(diào)pH至8.3，加去離子水定容至1 L后，室溫保存。使用時(shí)稀釋50倍即為1×TAE電泳緩沖液。

B.1.13  瓊脂糖。

B.1.14  溴化乙錠（EB）或其他核酸染料。

B.1.15  6×上樣緩沖液。

B.1.16  分子量Marker：至少包含100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1500bp條帶。

B.1.17  微量移液器及對(duì)應(yīng)吸頭：0.5µL～2µL，2µL ～20µL，20µL ～200µL，200µL～1000µL。

B.2 儀器和設(shè)備

B.2.1  低溫冷凍離心機(jī)：控溫4℃～8℃，zui大轉(zhuǎn)速不小于13000 rpm。

B.2.2  PCR儀。

B.2.3  天平：感量0.01g。

B.2.4  核酸電泳儀，包括電源、電泳槽、制膠槽（長(zhǎng)度>10cm）和梳子。

B.2.5  凝膠成像系統(tǒng)或紫外成像儀。

B.2.6  微量加樣器：0.5µL～2µL，2µL～20µL，20µL～200µL，200µL～1000µL。

B.3 檢測(cè)步驟

B.3.1  DNA模板準(zhǔn)備

B.3.1.1  將平板或斜面上生長(zhǎng)的菌落懸浮于200 µL 0.85%滅菌生理鹽水中，充分打散形成菌懸液，13000 rpm離心3 min。

B.3.1.2  棄掉上清液，使用1 mL滅菌去離子水充分混勻菌體，于100 °C水浴或者金屬浴維持10 min。

B.3.1.3  冰浴冷卻后，13000 rpm離心3 min，收集上清液，用滅菌去離子水按1:10稀釋上清液，取2 µL作為PCR檢測(cè)的模板。

B.3.1.4  也可用*提取基因組DNA，按照*說(shuō)明書進(jìn)行操作；所有處理后的DNA模板在-20°C以下保存?zhèn)溆谩?/p>

B.3.2  PCR對(duì)照

    每次PCR反應(yīng)使用EPEC、EIEC、ETEC、STEC/EHEC、EAEC標(biāo)準(zhǔn)菌株或陽(yáng)性對(duì)照品作為陽(yáng)性對(duì)照。同時(shí)，使用大腸埃希氏菌ATCC 25922作為陰性對(duì)照，使用滅菌去離子水作為空白對(duì)照，控制PCR體系污染。

B.3.3  PCR反應(yīng)體系配制及擴(kuò)增

每個(gè)樣品初篩需配置12個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，對(duì)應(yīng)檢測(cè)12個(gè)目標(biāo)基因，具體操作如下：

B.3.3.1 使用TE溶液（pH8.0）將合成的引物干粉稀釋成100 µmol/L儲(chǔ)存液。

B.3.3.2 根據(jù)表B.1中每種目標(biāo)基因?qū)?yīng)PCR體系內(nèi)引物的終濃度，使用滅菌去離子水配制12種目標(biāo)基因擴(kuò)增所需的10×引物工作液（以u(píng)idA基因?yàn)槔?，如表B.2）。

表B.1 五種致瀉大腸埃希氏菌目標(biāo)基因引物序列及每個(gè)PCR體系內(nèi)的終濃度

引物名稱

引物序列c

終濃度n（µmol/L）

PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度(bp)

uidA–F

5′-ATG CCA GTC CAG CGT TTT TGC-3′

0.2

1487

uidA–R

5′-AAA GTG TGG GTC AAT AAT CAG GAA GTG-3′

0.2

escV–F

5′-ATT CTG GCT CTC TTC TTC TTT ATG GCT G-3′

0.4

544

escV–R

5′-CGT CCC CTT TTA CAA ACT TCA TCG C-3′

0.4

eae-Fa

5′-ATT ACC ATC CAC ACA GAC GGT-3′

0.2

397

eae-Ra

5′-ACA GCG TGG TTG GAT CAA CCT-3′

0.2

bfpB–F

5′-GAC ACC TCA TTG CTG AAG TCG-3′

0.1

910

bfpB–R

5′-CCA GAA CAC CTC CGT TAT GC-3′

0.1

stx1–F

5′-CGA TGT TAC GGT TTG TTA CTG TGA CAG C-3′

0.2

244

stx1–R

5′-AAT GCC ACG CTT CCC AGA ATT G-3′

0.2

stx2–F

5′-GTT TTG ACC ATC TTC GTC TGA TTA TTG AG-3′

0.4

324

stx2–R

5′-AGC GTA AGG CTT CTG CTG TGA C-3′

0.4

lt–F

5′-GAA CAG GAG GTT TCT GCG TTA GGT G-3′

0.1

655

lt–R

5′-CTT TCA ATG GCT TTT TTT TGG GAG TC-3′

0.1

stp–F

5′-CCT CTT TTA GYC AGA CAR CTG AAT CAS TTG-3′

0.4

157

stp–R

5′-CAG GCA GGA TTA CAA CAA AGT TCA CAG-3′

0.4

sth–F

5′-TGT CTT TTT CAC CTT TCG CTC-3′

0.2

171

sth–R

5′-CGG TAC AAG CAG GAT TAC AAC AC-3′

0.2

invE–F

5′-CGA TAG ATG GCG AGA AAT TAT ATC CCG-3′

0.2

766

invE–R

5′-CGA TCA AGA ATC CCT AAC AGA AGA ATC AC-3′

0.2

 ipaH-Fb

5′-TTG ACC GCC TTT CCG ATA CC-3′

0.1

647

 ipaH-Rb

5′-ATC CGC ATC ACC GCT CAG AC-3′

0.1

aggR–F

5′-ACG CAG AGT TGC CTG ATA AAG-3′

0.2

400

aggR–R

5′-AAT ACA GAA TCG TCA GCA TCA GC-3′

0.2

pic–F

5′-AGC CGT TTC CGC AGA AGC C-3′

0.2

1111

pic–R

5′-AAA TGT CAG TGA ACC GAC GAT TGG-3′

0.2

astA–F

5′-TGC CAT CAA CAC AGT ATA TCC G-3′

0.4

102

astA–R

5′-ACG GCT TTG TAG TCC TTC CAT-3′

0.4

16S rDNA-F

5′-GGA GGC AGC AGT GGG AAT A-3′

0.25

1062

16S rDNA-R

5′-TGA CGG GCG GTG TGT ACA AG-3′

0.25

  注： a：escV和eae基因選作其中一個(gè)；b：invE和ipaH基因選作其中一個(gè)；c：表中不同基因的引物序列可采用可靠性驗(yàn)證的其他序列代替。

表B.2 每種目標(biāo)基因擴(kuò)增所需10×引物工作液配制表

引物名稱

體積（µL）

100 µmol/L uidA–F

10×n

100 µmol/L uidA–R

10×n

滅菌去離子水

100 - 2×（10×n）

總體積

100

注： n：每條引物在反應(yīng)體系內(nèi)的終濃度（詳見(jiàn)表B.1）。

B.3.3.3  將10×引物工作液、10×PCR反應(yīng)緩沖液、25 mmol/L MgCl2、2.5 mmol/L dNTPs、滅菌去離子水從-20℃冰箱中取出，融化并平衡至室溫，使用前混勻；5 U/µL Taq酶在加樣前從-20℃冰箱中取出。

B.3.3.4  每個(gè)樣品按照表B.3的加液量配制12個(gè)25 µL反應(yīng)體系，分別使用12種目標(biāo)基因?qū)?yīng)10×引物工作液。

   表B.3 五種致瀉大腸埃希氏菌目標(biāo)基因擴(kuò)增體系配制表

試劑名稱

加樣體積（µL）

滅菌去離子水

12.1

10×PCR 反應(yīng)緩沖液

2.5

25 mmol/L MgCl2

2.5

2.5 mmol/L dNTPs

3.0

10×引物工作液

2.5

5 U/µL Taq酶

0.4

DNA模板

2.0

總體積

25

B.3.3.5  按照如下反應(yīng)條件設(shè)置PCR儀：預(yù)變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 30 s，復(fù)性63 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)；zui后72 ℃延伸5 min。

B.3.3.6  將配制完成的PCR反應(yīng)管放入PCR儀中，核查PCR反應(yīng)條件正確后，啟動(dòng)反應(yīng)程序。

B.3.4瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物

B.3.4.1  稱量4 g瓊脂糖粉，加入至200 mL的1×TAE電泳緩沖液中，充分混勻。使用微波爐反復(fù)加熱至沸騰，直到瓊脂糖粉*融化形成清亮透明的溶液。

B.3.4.2  待瓊脂糖溶液冷卻至60 ℃左右時(shí)，加入溴化乙錠（EB）至終濃度為0.5 µg/mL，充分混勻后，輕輕倒入已放置好梳子的模具中，凝膠的長(zhǎng)度要大于10 cm，適宜厚度為3 mm～5 mm。檢查梳齒下或梳齒間有無(wú)氣泡，用一次性吸頭小心排掉瓊脂糖凝膠中的氣泡。

B.3.4.3  當(dāng)瓊脂糖凝膠*凝結(jié)硬化后，輕輕拔出梳子，小心將膠塊和膠床放入電泳槽中，樣品孔在陰。

B.3.4.4 向電泳槽中加入1×TAE電泳緩沖液，液面高于膠面1 mm~2 mm 。

B.3.4.5 將5 µL PCR產(chǎn)物與1 µL 6×上樣緩沖液混勻后，用微量移液器吸取混合液垂直伸入液面下膠孔中，小心上樣于孔中；陽(yáng)性對(duì)照的PCR反應(yīng)產(chǎn)物加入到zui后一個(gè)泳道；*個(gè)泳道中加入2 µL分子量Marker 。

B.3.4.6  接通電泳儀電源，根據(jù)公式：電壓=電泳槽正負(fù)極間的距離（cm）×5 V/cm計(jì)算并設(shè)定電泳儀電壓數(shù)值；啟動(dòng)電壓開(kāi)關(guān)，電泳開(kāi)始以正負(fù)極鉑金絲出現(xiàn)氣泡為準(zhǔn)。

B.3.4.7  電泳30 min～45 min后，切斷電源。取出凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)或紫外成像儀中觀察結(jié)果，拍照并記錄數(shù)據(jù)。

B.3.5 結(jié)果判定

B.3.5.1   電泳結(jié)果中空白對(duì)照無(wú)條帶出現(xiàn)，陰性對(duì)照僅有uidA條帶擴(kuò)增，陽(yáng)性對(duì)照中出現(xiàn)所有目標(biāo)條帶，PCR檢測(cè)結(jié)果成立。

B.3.5.2   根據(jù)電泳圖中目標(biāo)條帶大小，判斷目標(biāo)條帶的種類，記錄每個(gè)泳道中目標(biāo)條帶的種類。

B.3.5.3   在表B.4中查找不同目標(biāo)條帶種類及組合所對(duì)應(yīng)的致瀉大腸埃希氏菌類別。

表B.5 五種致瀉大腸埃希氏菌目標(biāo)條帶與型別對(duì)照表

致病型別

目標(biāo)條帶的種類組合

EAEC

aggR（+）

uidAc（+/-）

EPEC

bfpB（+/-）, escVa（+）, stx1（-）, stx2（-）

STEC/EHEC

escV a（+/-）, stx1（+）, stx2（-）, bfpB（-）

escV a（+/-）stx1（-）, stx2（+）, bfpB（-）

escV a（+/-）, stx1（+）, stx2（+）, bfpB（-）

ETEC

lt, stp, sth中一條或一條以上陽(yáng)性

EIEC

invEb（+）

注：a：在判定EPEC或SETC/EHEC時(shí)，escV與eae基因等同效果；b：在判定EIEC時(shí)，invE與iapH基因等同效果。c：uidA+：97%以上大腸埃希氏菌為陽(yáng)性。