1 范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）的檢驗(yàn)方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于嬰幼兒配方食品、乳和乳制品及其原料中阪崎腸桿菌的檢驗(yàn)。

2 設(shè)備和材料

除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：

2.1 恒溫培養(yǎng)箱：25 ℃±1 ℃，36 ℃±1 ℃，44 ℃±0.5 ℃。

2.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。

2.3 恒溫水浴箱：44 ℃±0.5 ℃。

2.4 天平：感量0.1 g。

2.5 均質(zhì)器。

2.6 振蕩器。

2.7 無菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭。

2.8 無菌錐形瓶：容量100 mL、200 mL、2000 mL。

2.9 無菌培養(yǎng)皿：直徑90 mm。

2.10 pH 計(jì)或pH 比色管或精密pH 試紙。

2.11 全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)。

3 培養(yǎng)基和試劑

3.1 緩沖蛋白胨水（buffer peptone water，BPW）：見附錄A 中A.1。

3.2 改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-*（modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycin

medium，mLST-Vm）：見附錄A 中A.2。

3.3 阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基。

3.4 胰蛋白胨大豆瓊脂（trypticase soy agar，TSA）：見附錄A 中A.3。

3.5 生化鑒定試劑盒。

3.6 氧化酶試劑：見附錄A 中A.4。

3.7 L-賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基：見附錄A 中A.5。

3.8 L-*脫羧酶培養(yǎng)基：見附錄A 中A.6。

3.9 L-*雙水解酶培養(yǎng)基：見附錄A 中A.7。

3.10 糖類發(fā)酵培養(yǎng)基：見附錄A 中A.8。

3.11 西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基：見附錄A 中A.9。

*法阪崎腸桿菌的檢驗(yàn)

4 檢驗(yàn)程序

阪崎腸桿菌檢驗(yàn)程序見圖1。

5 操作步驟

5.1 前增菌和增菌

取檢樣100 g（mL）加入已預(yù)熱至44 ℃裝有900 mL 緩沖蛋白胨水的錐形瓶中，用手緩緩地?fù)u動(dòng)至充分溶解，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18 h±2 h。移取1 mL 轉(zhuǎn)種于10 mL mLST-Vm 肉湯，44 ℃±0.5 ℃培養(yǎng)24 h±2h。

5.2 分離

5.2.1 輕輕混勻mLST-Vm 肉湯培養(yǎng)物，各取增菌培養(yǎng)物1 環(huán)，分別劃線接種于兩個(gè)阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基平板，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h±2 h。

5.2.2 挑取1 個(gè)～5 個(gè)可疑菌落，劃線接種于TSA 平板。25 ℃±1 ℃培養(yǎng)48 h±4 h。

5.3 鑒定

自TSA 平板上直接挑取黃色可疑菌落，進(jìn)行生化鑒定。阪崎腸桿菌的主要生化特征見表1?？蛇x擇生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)。

第二法 阪崎腸桿菌的計(jì)數(shù)

7 操作步驟

7.1 樣品的稀釋

7.1.1 固體和半固體樣品：無菌稱取樣品100 g、10 g、1 g 各三份，加入已預(yù)熱至44 ℃分別盛有900 mL、90 mL、9 mL BPW 中，輕輕振搖使充分溶解，制成1:10 樣品勻液，置36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18 h±2 h。分別移取1 mL 轉(zhuǎn)種于10 mL mLST-Vm 肉湯，44 ℃±0.5 ℃培養(yǎng)24 h±2 h。

7.1.2 液體樣品：以無菌吸管分別取樣品100 mL、10 mL、1 mL 各三份，加入已預(yù)熱至44 ℃分別盛有900 mL、90 mL、9 mL BPW 中，輕輕振搖使充分混勻，制成1:10 樣品勻液，置36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18h±2h。分別移取1 mL 轉(zhuǎn)種于10 mL mLST-Vm 肉湯，44 ℃±0.5 ℃培養(yǎng)24 h±2 h。

7.2 分離、鑒定

同5.2，5.3。

8 結(jié)果與報(bào)告

綜合菌落形態(tài)、生化特征，根據(jù)證實(shí)為阪崎腸桿菌的陽性管數(shù)，查MPN 檢索表，報(bào)告每100 g（mL）樣品中阪崎腸桿菌的MPN 值（見附錄Ｂ中表B.1）

附錄A

（規(guī)范性附錄）

培養(yǎng)基和試劑

A.1 緩沖蛋白胨水（BPW）

A.1.1 成分

蛋白胨 10.0g

氯化鈉 5.0 g

*（Na2HPO4·12H2O） 9.0 g

磷酸二氫鉀 1.5 g

蒸餾水 1 000 mL

pH 7.2

A.1.2 制法

加熱攪拌至溶解,調(diào)節(jié)pH，121 ℃高壓滅菌15 min。

A.2 改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-*（Modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycinmedium，mLST-Vm）

A.2.1 改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（mLST）肉湯

A.2.1.1 成分

氯化鈉 34.0 g

胰蛋白胨 20.0 g

乳糖 5.0 g

磷酸二氫鉀 2.75 g

* 2.75 g

十二烷基硫酸鈉 0.1 g

蒸餾水 1 000 mL

pH 6.8±0.2

A.2.1.2 制法

加熱攪拌至溶解，調(diào)節(jié) pH。分裝每管10 mL，121 ℃高壓滅菌15 min。

A.2.2 *溶液

A.2.2.1 成分

* 10.0 mg

蒸餾水 10.0 mL

A.2.2.2 制法

10.0 mg *溶解于10.0 mL 蒸餾水，過濾除菌。*溶液可以在0 ℃～5 ℃保存15 天。

A.2.3 改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-*（Modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycinmedium，mLST-Vm）

每 10 mL mLST 加入*溶液0.1 mL，混合液中*的終濃度為10 μg/ mL。

注：mLST-Vm 必須在24 h 之內(nèi)使用。

A.3 胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）

A.3.1 成分

胰蛋白胨 15.0 g

植物蛋白胨 5.0 g

氯化鈉 5.0 g

瓊脂 15.0 g

蒸餾水 1 000 mL

pH 7.3±0.2

A.3.2 制法

加熱攪拌至溶解，煮沸 1 min，調(diào)節(jié)pH，121 ℃高壓15 min。

A.4 氧化酶試劑

A.4.1 成分

N,N,N',N'-四甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽 1.0 g

蒸餾水 100 mL

A.4.2 制法

少量新鮮配制，于冰箱內(nèi)避光保存，在 7 d 之內(nèi)使用。

A.4.3 試驗(yàn)方法

用玻璃棒或一次性接種針挑取單個(gè)特征性菌落，涂布在氧化酶試劑濕潤(rùn)的濾紙平板上。如果濾紙?jiān)?0 s 之內(nèi)未變?yōu)樽霞t色、紫色或深藍(lán)色，則為氧化酶試驗(yàn)陰性，否則即為氧化酶實(shí)驗(yàn)陽性。

注：實(shí)驗(yàn)中切勿使用鎳/鉻材料。

A.5 L-賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基

A.5.1 成分

L-賴氨酸鹽酸鹽（L-lysine monohydrochloride） 5.0 g

酵母浸膏 3.0 g

葡萄糖 1.0 g

溴甲酚紫 0.015 g

蒸餾水 1 000 mL

pH 6.8±0.2

A.5.2 制法

將各成分加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié) pH。每管分裝5 mL，121 ℃高壓15 min。

A.5.3 實(shí)驗(yàn)方法

挑取培養(yǎng)物接種于 L-賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基，剛好在液體培養(yǎng)基的液面下。30 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h±2 h，觀察結(jié)果。L-賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)陽性者，培養(yǎng)基呈紫色，陰性者為黃色。

A.6 L-*脫羧酶培養(yǎng)基

A.6.1 成分

L-*鹽酸鹽（L-ornithine monohydrochloride） 5.0 g

酵母浸膏 3.0 g

葡萄糖 1.0 g

溴甲酚紫 0.015 g

蒸餾水 1 000 mL

pH 6.8±0.2

A.6.2 制法

將各成分加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié) pH。每管分裝5 mL。121 ℃高壓15 min。

A.6.3 實(shí)驗(yàn)方法

挑取培養(yǎng)物接種于 L-*脫羧酶培養(yǎng)基，剛好在液體培養(yǎng)基的液面下。30 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h±2 h，觀察結(jié)果。L-*脫羧酶試驗(yàn)陽性者，培養(yǎng)基呈紫色，陰性者為黃色。

A.7 L-*雙水解酶培養(yǎng)基

A.7.1 成分

L-*鹽酸鹽（L-arginine monohydrochloride） 5.0 g

酵母浸膏 3.0 g

葡萄糖 1.0 g

溴甲酚紫 0.015 g

蒸餾水 1 000 mL

pH 6.8±0.2

A.7.2 制法

將各成分加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié) pH。每管分裝5 mL。121 ℃高壓15 min。

A.7.3 實(shí)驗(yàn)方法

挑取培養(yǎng)物接種于 L-*脫羧酶培養(yǎng)基，剛好在液體培養(yǎng)基的液面下。30 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h±2 h，觀察結(jié)果。L-*脫羧酶試驗(yàn)陽性者，培養(yǎng)基呈紫色，陰性者為黃色。

A.8 糖類發(fā)酵培養(yǎng)基

A.8.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

A.8.1.1 成分

酪蛋白（酶消化） 10.0 g

氯化鈉 5.0 g

酚紅 0.02 g

蒸餾水 1 000 mL

pH 6.8±0.2

A.8.1.2 制法

將各成分加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié) pH。每管分裝5 mL。121 ℃高壓15 min。

A.8.2 糖類溶液（D-*、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁甙）

A.8.2.1 成分

糖 8.0 g

蒸餾水 100 mL

A.8.2.2 制法

分別稱取 D-*、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁甙等糖類成分各8 g，溶于100 mL 蒸餾水中，過濾除菌，制成80 mg/mL 的糖類溶液。

A.8.3 *培養(yǎng)基

A.8.3.1 成分

基礎(chǔ)培養(yǎng)基 875 mL

糖類溶液 125 mL

A.8.3.2 制法

無菌操作，將每種糖類溶液加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，混勻；分裝到無菌試管中，每管 10 mL。

A.8.4 實(shí)驗(yàn)方法

挑取培養(yǎng)物接種于各種糖類發(fā)酵培養(yǎng)基，剛好在液體培養(yǎng)基的液面下。30 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h±2 h，觀察結(jié)果。糖類發(fā)酵試驗(yàn)陽性者，培養(yǎng)基呈黃色，陰性者為紅色。

A.9 西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基

A.9.1 成分

檸檬酸鈉 2.0 g

氯化鈉 5.0 g

* 1.0 g

磷酸二氫銨 1.0 g

* 0.2 g

溴百里香酚藍(lán) 0.08 g

瓊脂 8.0 g～18.0 g

蒸餾水 1 000 mL

pH 6.8±0.2

A.9.2 制法

將各成分加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié) pH。每管分裝10 mL，121 ℃高壓15 min，制成斜面。

A.9.3 實(shí)驗(yàn)方法

挑取培養(yǎng)物接種于整個(gè)培養(yǎng)基斜面，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h±2 h，觀察結(jié)果。陽性者培養(yǎng)基變?yōu)樗{(lán)色。

附錄B

（規(guī)范性附錄）

阪崎腸桿菌zui可能數(shù)（MPN）檢索表

B.1 阪崎腸桿菌zui可能數(shù)（MPN）檢索表

每100 g（mL）檢樣中阪崎腸桿菌zui可能數(shù)（MPN）的檢索見表B.1。