平板計數(shù)瓊酯(Plate Count Agar，PCA)是用來檢測飲用水中異養(yǎng)菌(Heterotrophic Plate Count，HPC)的常用培養(yǎng)基，其營養(yǎng)含量高，歷*應用zui廣泛。但從2O世紀7O年代末開始，越來越多的檢測證實，采用PCA 將明顯低估了異養(yǎng)菌的真實數(shù)量，根據(jù)PCA計數(shù)結果來評價水處理的有效性及管網(wǎng)的清潔、衛(wèi)生程度并不可靠，飲用水的致病風險很可能較預期高得多。提高檢測技術的靈敏度，獲得盡可能高的計數(shù)仍應視為飲用水微生物學研究的重要內(nèi)容。

1 HPC結果偏低的原因分析

   PCA等培養(yǎng)基可能只檢出了水樣細菌總數(shù)中很少的一部分，其他未檢出細菌根本就不能在檢測環(huán)境中生長，或者生長相對緩慢，在設定時間內(nèi)不能形成可見菌落。

1．1 細菌存活但不能被檢出

   弧菌(Vibrio)、埃希氏菌(Eschericha)、沙門氏菌(Salmonella)、氣單胞菌(Aeromonas)、彎曲桿菌(Campylobacter)、志賀氏菌(Shigella)等都被證實存在具有生命活性但不能被培養(yǎng)檢出。在培養(yǎng)基平板上，這些細菌不能形成可見菌落，但存活直接培養(yǎng)表明它們具有代謝活力。顯而易見，常規(guī)檢測技術遺漏了這些細菌，造成結果報告偏低。這也可用來解釋發(fā)生軍團菌流行病時，往往不能從水樣中檢出侵肺軍團菌(Legionella pneumophila)等致病菌的現(xiàn)象。

1．2 培養(yǎng)基的選擇性

   由于細菌生理、生化特征的多樣性、沒有哪種培養(yǎng)基可將水樣中的存活細菌全部檢出，每種培養(yǎng)基都趨向于只計數(shù)適應該種營養(yǎng)條件的一類細菌。如果某種培養(yǎng)基的選擇性弱，則其可檢出更大量的細菌。

   用目前可利用的幾種培養(yǎng)基檢測相同水樣，計數(shù)結果往往有顯著差異，表明這些培養(yǎng)基都具有較強的選擇性。此外，由于對出廠水或管網(wǎng)水進行了消毒處理，只有少數(shù)優(yōu)勢種才能存活、繁殖，培養(yǎng)基選擇對其能否被檢出影響相當大，有的培養(yǎng)基可能根本就不支持這些優(yōu)勢種的生長，有的則比較正常。

1．3 培養(yǎng)方法的固有缺陷

   用傾倒平皿檢測法，培養(yǎng)基平板上生長起來的菌落可能起源于單個或多個細菌。如果是多個細菌團聚在一起，或者多個細菌同時粘附到某個無機或有機顆粒物表面，而水樣前處理，主要是人工或機械混勻，不能使團聚或粘附細菌彼此分離，則zui終只能形成一個菌落，必然導致對總數(shù)量的低估。

1．4 細菌的脅迫受損與再生長

   消毒不充分或樣水保存不當都可能使細菌處于亞致死的受損狀態(tài)。這些結構或代謝受損的細菌不能在含有表面活性劑的選擇性培養(yǎng)基上生長并形成菌落。然而，進入管網(wǎng)后，受損細菌可能完成恢復性生長，以致管網(wǎng)末梢水中細菌的檢出量高于出廠水。由于表面的物理保護作用，顆粒物，包括顆?；钚蕴?GAC)，往往成為受損菌的重要載體n]。種源

菌在管網(wǎng)內(nèi)繁殖再生長，帶來的不利影響包括：(1)產(chǎn)生異臭異味；(2)微生物腐蝕管道內(nèi)壁；(3)干擾對大腸菌的檢測；(4)消毒劑殘余量低或失效期間的健康風險，如假單胞菌(Pseudomones)、莫拉氏菌(Moraxella)或黃桿菌(Flavobacterium)等的致病作用。環(huán)境溫度、水中可生物降解有機物的含量、水流速度、水體濁度、管網(wǎng)中消毒劑殘余量等控制受損菌的再生長程度。

   傾倒平皿檢測法使細菌遭受熱沖擊，受損菌可能不能在檢測期內(nèi)修復生長，導致少計。

   有機物組成廣泛但含量低的培養(yǎng)基有利于受損菌修復生長。為更真實地檢出水中細菌的數(shù)量，適當調(diào)整培養(yǎng)基組成是必要的。

2 提高HPC計數(shù)結果的途徑

   使用PCA培養(yǎng)基，用傾倒法檢測水中細菌總數(shù)的技術穩(wěn)定，但由于PCA具有選擇性，而且不能檢出產(chǎn)色素菌，因此降低了反映真實結果的價值，需要改進現(xiàn)行方法，提高檢測靈敏度。

2．1 直接計數(shù)法

2．1．1 掃描電鏡觀察計數(shù)

   用掃描電鏡計數(shù)水生細菌是有效的l2]，其技術關鍵有2點：(1)要能將水樣中的細菌全部分離出來；(2)具備區(qū)分細菌與非細菌成分的熟練技術。

2．1．2 熒光顯微鏡觀察計數(shù)

   熒光顯微鏡觀察計數(shù)法快捷，從取樣到檢出只要20—30分鐘，而且靈敏性好。操作程序是先固定水樣，然后用化學熒光物染色，再真空過濾到不產(chǎn)生熒光的聚碳酸酯膜上，zui后在熒光顯微鏡下觀察。吖啶橙色染料(Acridine Orange，AO)是常用染色物質(zhì)，能與RNA和DNA反應而產(chǎn)生熒光。與其他直接計數(shù)技術一樣，熒光顯微鏡觀察法不能區(qū)分細菌種類，分析代謝活性或判斷是否處于存活狀態(tài)。如果由于工作經(jīng)驗不足，將死亡細菌、碎屑物混計在內(nèi)，則會過高估計活細菌總數(shù)。有些研究將AO染色與測代謝活性的方法結合起來，如A()-INT[3]，提高了檢測準確性。

直接計數(shù)法獲得的結果往往較標準平板法高出2個甚至更多個數(shù)量級。

2．2 改進接種方法

   傾倒平板法雖然簡單，但缺點也非常明顯：(1)盡管要求將培養(yǎng)基的傾倒溫度控制在45—46~C，然而熱沖擊依然存在；(2)平板表層以下的菌落生長慢，而且不便于轉(zhuǎn)種培養(yǎng)；(3)水樣體積的限制（＜2ml）

   實踐表明下述兩種接種方法的應用效果良好。

2．2．1 均勻涂布接種

   首先是制備具有吸附能力的干燥培養(yǎng)基。將15mL已滅菌培養(yǎng)基倒入lOOmm×15mm 或90mm×15mm平皿中，翻轉(zhuǎn)，42℃恒溫固化24 h，使水分喪失2～3g后立即使用，或用塑料袋封好在4C儲存，有效期不應超過2周。如果需要當日制備并使用，則將25mL培養(yǎng)基倒入平皿中，不加蓋，室溫(24～ 26℃)下在層流通風柜內(nèi)干燥，同樣使水分喪失2-3g。

   將0．1～0．5mL水樣均勻涂布到培養(yǎng)基表面的方法有兩種：(1)使用長200mm，直徑4mm，一端45。彎曲的玻璃棒，人工將樣水推開；(2)使用轉(zhuǎn)臺，將平皿固定在轉(zhuǎn)臺上，啟動旋轉(zhuǎn)，前后擺動移液管(止于距邊緣0．5cm處)，將水樣緩慢釋放出來。不論采用何種方法，都要保證水樣被*吸收。均勻涂布接種法獲得的結果總是不同程度地高出傾倒平皿法。尤其計數(shù)海洋細菌時，均勻涂布的平均計數(shù)幾乎為傾倒法的3倍。

2．2．2 濾膜計數(shù)法

   由Taylor和Geldreich提出了用濾膜計數(shù)水中細菌總數(shù)的方法l4]，使用培養(yǎng)基命名為rn—sPC，已商業(yè)化生產(chǎn)，可在市場上購買到。濾膜法的優(yōu)勢在于可檢測大量低濁度水樣，尤其適合分析潔凈水(< 1-10CFU／mL)。事實上，如果將水樣量由lOOmL增至300mL，細菌的檢出率明顯增加。在對722個水樣的檢測中，若只取1OOmL水樣，則有259例不能檢出，但將水樣量增至300mL，則其中32 的水樣有細菌有檢出。

   在大多數(shù)情況下，濾膜法獲得的計數(shù)結果高于傾倒平皿法。此外，產(chǎn)色素菌在濾膜上生長速度快，而且易挑出單菌落進行種類鑒定及生化分析。但是，濾膜法檢測可能受濾膜質(zhì)量等因素影響。

2．3 調(diào)整培養(yǎng)溫度和時間

   出于腸道衛(wèi)生學考慮，歷*將培養(yǎng)細菌總數(shù)的環(huán)境溫度控制在37℃ ，后來確定為35℃ 培養(yǎng)48h。大量對比實驗表明，35℃ 肯定是zui不適宜獲得zui高菌落數(shù)的溫度，計數(shù)結果不及28℃ 時的14％ ，20℃時的20 。鑒于細菌總數(shù)用作評價凈水效率的價值高于其衛(wèi)生學意義，很多學者贊同降低培養(yǎng)溫度(20℃或28℃)，延長培養(yǎng)時間(5～7d)，以此促使zui大數(shù)量的菌落出現(xiàn)在計數(shù)平板或濾膜上。細菌總數(shù)會隨培養(yǎng)時間延長而增加。一般情況下，12～14d可達到zui高計數(shù)，而在前6天，增長速率zui快。對平板計數(shù)技術，zui快增長發(fā)生在前2～4d。溫度越高，達到50 zui高菌落數(shù)所需時間越短。如以12～ 14dzui高值為標準，則達到5O 數(shù)量，35℃ 需4d，28℃ 需6d，20℃ 需8d。長期培養(yǎng)不適合開展常規(guī)檢測。建議在盡可能短的時間內(nèi)完成計數(shù)，必要情況下，將已計數(shù)平板繼續(xù)培養(yǎng)，定期觀察，記錄zui大值。

2。4 選用替代培養(yǎng)基

   目前可利用的替代培養(yǎng)基有高、低營養(yǎng)成分兩大類。高營養(yǎng)成分培養(yǎng)基有m—SPC培養(yǎng)基；低營養(yǎng)成分培養(yǎng)基有NWR1瓊酯、R2A 培養(yǎng)基、CPS培養(yǎng)基、DP瓊脂培養(yǎng)基，Henrici改良培養(yǎng)基等。

3 R2A培養(yǎng)基及其應用

3．1 R2A培養(yǎng)基的應用

   R2A培養(yǎng)基可用于傾倒平板、均勻涂布和濾膜檢測法。由于R2A培養(yǎng)基能促進受損細菌的恢復性再生長，其在20℃ 下培養(yǎng)7d獲得的zui高菌落數(shù)總是高于PCA和m—SPC(表1)。從表中還可看出，R2A均勻涂布法計數(shù)結果更高。相對于PCA，細菌在R2A 培養(yǎng)基上的生長速度要慢，形成的菌落要小，在48h內(nèi)，準確計數(shù)困難，因而需要延長培養(yǎng)時間，使菌落生長得足夠大，但不會或少融合生長。

   R2A培養(yǎng)基適合產(chǎn)色素菌生長。在3～5d內(nèi)，產(chǎn)色素菌可形成明顯的菌落。均勻涂布法計數(shù)產(chǎn)色素菌所獲得的結果比較理想。耐氯菌在R2A 培養(yǎng)基上生長良好。28℃ 培養(yǎng)5～7d后，生長緩慢的耐氯菌菌落開始出現(xiàn)，其對1．Omg／L的游離余氯的抵抗力很強。將PCA 上生長的菌落挑出，轉(zhuǎn)培養(yǎng)到新配PCA上，則有很多不能再生長。但如果將丙酮酸鈉以外的R2A其他組成成分雙倍配制，則新的培養(yǎng)基適合分離菌株的轉(zhuǎn)培養(yǎng)，從而有利于進行種類鑒定和生化特征研究。

R2A培養(yǎng)基已成功地用來檢測飲用水樣、GAC、管道內(nèi)壁生物膜、污損反滲透膜內(nèi)異養(yǎng)菌的數(shù)量，在可比培養(yǎng)條件下，R2A 計數(shù)結果總是zui高的，但也不排除由于地理區(qū)域差異，水中細菌種群不同，R2A培養(yǎng)基上生成菌落數(shù)反而減少的情況。

4 提高飲用水中細菌檢出率的技術細節(jié)考慮

   細菌總數(shù)是評價飲用水水質(zhì)的常規(guī)檢測項目，一些技術細節(jié)的規(guī)范化處理或改進有助于提高計數(shù)準確性，應嚴格按規(guī)程操作，本文不一一贅述。