細(xì)胞接種存活率只表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞數(shù)，但貼壁后的細(xì)胞不一定每個(gè)都能增殖和形成克隆。而形成克隆的細(xì)胞必為貼壁和有增殖活力的細(xì)胞。克隆形成率反映細(xì)胞群體依賴(lài)性和增殖能力兩個(gè)重要性狀。由于細(xì)胞生物學(xué)性狀不同，細(xì)胞克隆形成率差別也很大，一般初代培養(yǎng)細(xì)胞克隆形成率弱，傳代細(xì)胞系強(qiáng)；二倍體細(xì)胞克隆形成率弱，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系強(qiáng)；正常細(xì)胞克隆形成率弱，腫瘤細(xì)胞強(qiáng)。并且克隆形成率與接種密度有一定關(guān)系，做克隆形成率測(cè)定時(shí)，接種細(xì)胞一定要分散成單細(xì)胞懸液，直接接種在碟皿中，持續(xù)一周，隨時(shí)檢查，到細(xì)胞形成克隆時(shí)終止培養(yǎng)。

1、平板克隆形成試驗(yàn)

基本步驟：

（1）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單層培養(yǎng)細(xì)胞，用0.25%*消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，把細(xì)胞懸浮在10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中備用。

（2）將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋?zhuān)赃m當(dāng)?shù)募?xì)胞密度（根據(jù)增殖能力）接種于培養(yǎng)皿中。一般分每皿50、100、200個(gè)細(xì)胞的梯度密度分別接種含10mL 37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使細(xì)胞分散均勻。置37℃ 5% CO2及飽和濕度的環(huán)境下，靜置培養(yǎng)2～3周。

（3）經(jīng)常觀察，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加純甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL，固定15分鐘。然后去固定液，加適量Giemsa應(yīng)用染色液染10～30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

（4）將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆，或在顯微鏡（低倍鏡）計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。zui后計(jì)算克隆形成率。

克隆數(shù)

克隆形成率= —————×100%

接種細(xì)胞數(shù)

平板克隆形成試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，適用于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗(yàn)成功的關(guān)鍵是細(xì)胞懸液的制備和接種密度。細(xì)胞一定要分散得好，不能有細(xì)胞團(tuán)，接種密度不能過(guò)大。

2、軟瓊脂培養(yǎng)克隆形成試驗(yàn)

基本步驟：

（1）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%*消化并輕輕吹打，使之成為單細(xì)胞，作活細(xì)胞計(jì)數(shù)，用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1×106細(xì)胞/L。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求作梯度倍數(shù)稀釋。

（2）用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個(gè)濃度的低溶點(diǎn)瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40℃中不會(huì)凝固。

（3）按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基（含有2×抗生素和20%的小牛血清）混合后，取3mL混合液注入直徑6cm平皿中（10cm平皿加7～10mL），冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。

（4）按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基在無(wú)菌試管中相混以后，再向管中加入0.2mL的細(xì)胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37℃ 5%CO2溫箱中培養(yǎng)10～14天。

（5）把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞克隆數(shù)。計(jì)算形成率。

軟瓊脂培養(yǎng)法常用檢測(cè)腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。試驗(yàn)中瓊脂與細(xì)胞相混時(shí)，瓊脂溫度不宜超過(guò)40℃。接種細(xì)胞的密度每平方厘米不超過(guò)35個(gè)，一般6cm的平皿接種1000個(gè)細(xì)胞。正常細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下不能增殖，不適用于軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)。

提示：本文軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)屬于生化實(shí)驗(yàn)文章，主要介紹軟瓊脂、克隆形成方面的知識(shí)，內(nèi)容僅供學(xué)習(xí)交流與參考。

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