凡需進(jìn)行病理研究的標(biāo)本均需進(jìn)行固定。將組織置于某些化學(xué)試劑中，使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及應(yīng)用盡量接近于其生活狀態(tài)時(shí)的形態(tài)結(jié)構(gòu)和位置稱為固定。而用于免疫組化研究標(biāo)本的固定不僅是使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固，終止或減少外源性和內(nèi)源性細(xì)胞內(nèi)分解酶的反應(yīng)，防止組織細(xì)胞自溶，更重要的是保存組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原性，使抗原不失活，不發(fā)生彌散。

不同的抗原，其抗原穩(wěn)定性不同，依抗原耐受固定液的程度可分為：①不穩(wěn)定性抗原，如T淋巴細(xì)胞表面抗原屬此類抗原，一般以冰凍切片進(jìn)行免疫組化染色；②半穩(wěn)定性抗原，如B淋巴細(xì)胞的胞漿免疫球蛋白等；③較穩(wěn)定抗原，例如HBsAg、HBcAg、AFP、CEA、S—100、Keratin和部分多肽類激素等，其抗原性受固定劑種類、固定時(shí)間、溫度等影響不大。

固定劑的種類很多，性能不一，因此固定不同的組織應(yīng)選擇合適的固定劑，特別是標(biāo)記半穩(wěn)定抗原時(shí)，更要選擇合適的固定劑和固定條件。

一、固定液的種類

較好的固定液應(yīng)具有強(qiáng)滲透力，能迅速滲入至組織內(nèi)部；其次不會(huì)使組織發(fā)生過度收縮變形，并能使組織內(nèi)易觀察的成分得以凝固為不溶性物質(zhì)；還要使組織達(dá)到一定硬度，有較好的折光率。固定液分為簡(jiǎn)單固定液和混合固定液。

二、固定的方法

1．浸泡法

這是zui常用的固定法，將取好的組織直接浸泡在固定液中，固定的時(shí)間一般在2～24h它適用于動(dòng)物標(biāo)本、尸檢標(biāo)本及臨床活檢標(biāo)本等。

2．蒸氣法

比較小而薄的標(biāo)本可用鋨酸或甲醛蒸氣固定。主要用于血液、細(xì)胞涂片以及某些薄膜組織的固定。具體方法：在一有蓋培養(yǎng)皿內(nèi)滴人1％一2％鋨酸水溶液3滴，將涂片放人其中，固定30s至lmin左右，立即水洗后進(jìn)行染色。

3。注射、灌注固定法

主要適用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的固定。將固定液注入血管，以達(dá)到充分的固定。經(jīng)血管分支到達(dá)整個(gè)組織或全身

（1）局部灌注固定 固定肺組織可將固定液從氣管或支氣管注入，注入速度不要太快，用力均勻，注入量適當(dāng)，以免脹破肺泡。固定眼球組織可從眼后房注人固定液。固定肝、腎組織則可從肝、腎動(dòng)脈注入固定液，同時(shí)切斷其靜脈使得血液排出。腦組織的固定，必須先麻醉動(dòng)物，分離頸動(dòng)脈，注射器的針尖向著頭部的方向注入固定液。

（2）全身灌注固定 較大的動(dòng)物往往采取輸液方法，將固定液從一側(cè)頸總動(dòng)脈或股動(dòng)脈輸入，將另一側(cè)相應(yīng)的靜脈切開放血。固定液的輸入量因動(dòng)物而異，兔、貓約500～1000ml，猴、狗約1000—2000ml。

4．微波固定法

近幾年來微波固定法一直可見報(bào)道。經(jīng)微波固定的組織具有收縮較小、核膜清晰、染色質(zhì)均勻、分辨清晰等特點(diǎn)，但必須嚴(yán)格控制微波固定的時(shí)間和溫度。

三、固定的注意事項(xiàng)

1．固定液的量

固定組織時(shí)，必須有足夠的固定液，一般為組織塊體積的10～15倍。固定用的容器必須足夠大，組織材料不要太多，避免組織中的水分滲出而影響固定液的濃度。

2.固定的組織必須新鮮

組織取材后應(yīng)立即固定，否則，組織易收縮變形，并發(fā)生自溶現(xiàn)象。

3.組織塊的體積

組織塊的體積宜小而薄，一般用于免疫組化的組織大小宜為1．OcmXl．OcmX 0．2cm。組織太大，內(nèi)部得不到充分固定，導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)破壞，給切片帶來一定的困難，還增加非特異染色，同時(shí)浪費(fèi)試劑。

4．組織固定后的沖洗

組織固定后，因固定液滲到組織中，所以必須*沖洗，除去固定液，否則會(huì)影響下一步的脫水。特別對(duì)于長時(shí)間固定的標(biāo)本應(yīng)用流水沖洗，盡可能減少色素沉著。對(duì)于混合固定液固定的組織，更要及時(shí)沖洗，否則將影響免疫組化切片的質(zhì)量。

四、影響固定的因素

1．溫度

一般固定液固定效果隨溫度升高而加強(qiáng)，溫度一般在-70～37℃之間，·以室溫22℃常用。某些酶的固定要求在37℃以下進(jìn)行，而某些病毒的固定則要在低溫下進(jìn)行，如用丙酮在-20一-40℃之間固定30min*。對(duì)于臨床活檢標(biāo)本，固定時(shí)間要求短，實(shí)踐發(fā)現(xiàn)用中性甲醛在40℃左右固定2～3h即可。

2．濃度

10％中性甲醛、4％多聚甲醛zui合適，乙醇zui常用濃度為95延。在37℃或室溫固定，適合于許多蛋白質(zhì)、抗原，并能保持其與抗體的反應(yīng)能力。70％的乙醇固定能力zui強(qiáng)。

3．固定時(shí)間

固定時(shí)間要視組織塊的大小及固定液的種類、濃度、溫度而定。組織塊越大，固定時(shí)間越長；反之，組織塊越小，固定時(shí)間越短。固定液的穿透力與濃度成正比，固定的時(shí)間與溫度成反比?？傊潭ǖ臅r(shí)間應(yīng)根據(jù)條件而定。

沒有任何一種固定液適合于所有組織的固定，應(yīng)根據(jù)條件選擇合適的固定液，可以用多種固定液固定作對(duì)比，找到比較切合本單位實(shí)際的固定液。