C1q放射免疫測定法

心得 （0）

實驗試劑

CFD稀釋液（即VBS），10%三氯醋酸，C1q溶液

實驗設備

PEG（MW6 000），離心機

實驗步驟

1. C1q標記法C1q的同位素標記，一般用125I，也可用131I。

125I的標記有兩種方法，即氯胺T法和乳過氧化物酶法。下面介紹氯胺T法：
   1） 在100μl C1q（1mg/ml）中，加入100μCi125I，混勻，然后加入25μl 0.4mol/L PB（pH值7.4，含1mg氯胺T），冰浴中攪拌4～6min；

   2） 立即加入50μg/μl偏重亞硫酸鉀中止反應，再加入50μl 1%牛血清白蛋白作為載體蛋白；

   3） 過Sephadex G25柱（20cm×0.5cm，預先用pH值7.4、0.4mol/L PB平衡，并注入1ml 1%牛血清白蛋白），以與游離125I 分開；

   4） 以適當濃度分裝后，放-70℃保存。為減少自身凝集，加入0.02%Tween20。

2. 取標記好的C1q，用CFD稀釋到1mg/ml。

3. 7 000r/min離心30min（4℃），除去不溶性凝聚蛋白，上清液存放于4℃。

4. 取試管4支，每管加測定血清0.2ml，CFD 0.2ml，標記C1q 50μl（1μg/ml）。1、2管為測定管，3、4管為對照管。

5. 搖勻后，放25℃溫箱60min，取出再放4℃冰箱60min。

6. 各管加3ml PEG，zui終濃渡為2.5%，搖勻后，放4℃ 2h。

7. 3、4管加10%三氯醋酸，沉淀所有的蛋白。將4個管都以1 000r/min離心20min，去上清液，沉淀物放γ計數器內測cpm。

8. 計算

B=（a加b2加c加d2）×100

B：標記C1q結合量（%）。a、b：1、2管（測定管）cpm。c、d：3、4管（對照管）cpm。