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喹諾酮（QNS）定量檢測試劑盒（ELISA）

使用說明書

一、概要

喹諾酮（QNS）是近20年來迅速發(fā)展起來的一類十分重要的廣譜抗生素，能抑制細菌DNA螺旋酶，抗菌譜廣、、低毒、組織穿透力強。已成為獸醫(yī)臨診和水產(chǎn)養(yǎng)殖中zui重要的抗感染藥物之一，被大量用于治療、預(yù)防和促生長，由于其耐藥性和潛在的致癌性引起廣泛的關(guān)注。

酶聯(lián)免疫快速檢測試劑盒具有成本低廉、操作簡便、一次處理樣本量大等優(yōu)點，已成為常規(guī)的初步篩查方法。本試劑盒是應(yīng)用ELISA技術(shù)研發(fā)的新一代藥物殘留檢測產(chǎn)品，與儀器分析技術(shù)相比具有快速、簡便、準確和靈敏度高等特點，能zui大限度地減少操作誤差和工作強度。

二、用途

定量檢測動物組織 （肌肉、蝦、魚等）、血清和蜂蜜等樣本中喹諾酮（QNS）的殘留。

三、檢測原理

本試劑盒采用競爭酶聯(lián)免疫試驗。檢測的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)，微孔板預(yù)包被羊抗鼠IgG捕獲抗體，加入鼠抗喹諾酮抗體后，會與捕獲抗體連接。經(jīng)過孵育及洗板后，加入標準品、樣品及喹諾酮酶標記物（QNS-HRP），游離的喹諾酮（QNS）與喹諾酮酶標記物（QNS -HRP）競爭喹諾酮抗體結(jié)合位點。經(jīng)過孵育及洗板后，加入底物并孵育。結(jié)合的酶連接物將底物轉(zhuǎn)化為藍色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)終止液后使顏色由藍轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在450 nm 處測量，吸光度值與樣品中的喹諾酮濃度成反比，與標準曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣品中喹諾酮的含量。

四、檢測限

檢測限：0.1ng/ml（0.1ppb）

五、特異性

*………………………………………………100%

*………………………………………………96.6%

*………………………………………………112.3%

達氟沙星………………………………………………98%

*……………………………………………… 134%

噁喹酸  ………………………………………………105.3%

氟甲喹  …………………………………………………96.1%

麻保沙星………………………………………………92.3%

氨氟沙星………………………………………………110%

*…………………………………………… 87.7%

培氟沙星……………………………………………129.6%

*……………………………………………100.7%

六、試劑盒組成

每一個盒中的試劑足夠進行 96 個試驗（包括標準測定），試劑盒中的組份如下：

1、96孔酶標板1塊（12孔×8條）：預(yù)包被羊抗鼠IgG

2、標準液×6瓶（1ml/瓶）：

0ng/mL、0.1ng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL、8.1ng/mL

3、酶標記物（6mL）：辣根過氧化物酶標記的喹諾酮工作液

4、喹諾酮抗體（10mL）：鼠抗喹諾酮單克隆抗體工作液

5、底物液A（6mL）：過氧化脲

6、底物液B（6mL）：四甲基聯(lián)苯胺（TMB）

7、終止液（6mL）：2N H₂SO₄

8、濃縮洗滌液（20×）（25mL）：含Tween-20的磷酸鹽緩沖液（PBST）

9、其他：封板膜3張，自封袋1個，說明書1份

七、樣本處理

1、溶液配制

配液1：8%甲醇-水溶液

量取8ml甲醇加入到92ml去離子水中混勻。

配液2：0.05M磷酸鹽緩沖液（PH＝7.2）

稱取12.9g十二水合*和2.18g二水合*，加去離離子水溶解定容至1L。

配液3：洗滌工作液

用去離子水將20×濃縮洗滌液按1：19體積比進行稀釋（1份20×濃縮洗滌液+19份去離子水）用于酶標板的洗滌，洗滌工作液在4℃環(huán)境可保存一個月。

配液4：復(fù)溶工作液

用去離子水將2×濃縮復(fù)溶液按1：1體積比進行稀釋（1份2×濃縮復(fù)溶液+1份去離子水）用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶工作液在4℃環(huán)境可保存一個月。

2、樣本處理前須知

處理任何樣本時，都必須注意：

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必須使用潔凈實驗器具，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

（c）未處理的樣本冷凍保存。

3、蜂蜜前處理方法

方法一：

┅┅取1.0±0.05g 蜂蜜至50ml聚苯乙烯離心管中，加入5ml  8%甲醇-水溶液（見配液1），用渦旋儀渦動5min，使其充分溶解；

┅┅靜止10min；

┅┅取100ml加入300ml復(fù)溶工作液， 用渦旋儀渦動混勻；

┅┅取50ml用于分析。

注：稱取蜂蜜樣本之前請于60℃水浴30-60min，振蕩樣本充分混勻后再取樣。

方法二：

----取1.0±0.05g蜂蜜樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，加入2ml0.05M磷酸鹽緩沖液（見配液2），用振蕩器振蕩至蜂蜜全部溶解；

----加入8ml二氯甲烷，用振蕩器振蕩5min,3000g以上離心5min；

----輕吸掉上層，取下層有機相4ml至10ml干凈的玻璃試管中，于50～60℃氮氣流下吹干；

----用1ml復(fù)溶工作液溶解干燥的殘留物；

-----取50ml用于分析。

八、檢測步驟

仔細的洗滌非常重要。避免在操作過程中微孔出現(xiàn)干燥。

1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20-25℃）平衡30min以上。

2、準備：取出需要數(shù)量的微孔板，將用剩的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。將微孔板條插入微孔架，標準品和樣品做兩個平行實驗，記錄下標準品和樣品的位置。

3、加抗體：每孔加入100μL抗體溶液，37℃恒溫箱孵育30分鐘。

4、洗板：倒出孔中的液體，將微孔架倒置在干凈吸水紙上拍打，以保證*除去孔中的液體。每孔加滿稀釋后的洗滌工作液，靜置20秒鐘，甩去液體，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次。

5、加標準品/樣品：加入50μL標準品或處理好的樣品到各自的微孔中，標準品和樣品做兩個平行實驗，然后加入50μL酶標記物到微孔，小心地充分混合，37℃恒溫箱孵育30分鐘。

6、重復(fù)3的操作。

7、顯色：每孔先加入底物液A 50μL，再加入底物液B 50μL，37℃避光孵育15min（如果顯色過淺，可適當(dāng)延長孵育時間，反之亦然）。

8、測定：每孔加入終止液50μL，設(shè)定酶標儀于450nm處，測定每孔OD值。

九、結(jié)果判定

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ppb標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪制與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，以喹諾酮標準品濃度（ppb）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中克侖特羅的實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（索?。?/span>

十、注意事項

1、嚴格按照說明書操作時間，每加一種試劑前需要將其搖勻，各操作步驟緊湊進行。

2、室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標準的OD值偏低。

3、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。

4、試劑變質(zhì)的跡象

底物有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標準的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

5、不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

6、在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色15min即可。若顏色較淺，可延長反應(yīng)時間到25min（或更長），但不得超過30min。反之，則減短反應(yīng)時間。

7、反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

十一、貯存條件及有效期

貯存條件：2-8℃、干燥避光防潮。

有效期：在正確貯存條件下，有效期為12個月。