CIK細胞細胞制備方法詳解
【細胞制備】
1．外周血單個核細胞的采集
1.1用血細胞分離機采集患者自身的外周血單個核細胞50-100mL；
1.2淋巴細胞分離液密度梯度離心法進一步純化單個核細胞（PBMC）；
1.3無血清培養(yǎng)液洗滌2次，獲得純度在90%以上的PBMC。
2．CIK細胞的培養(yǎng)及鑒定
2.1將PBMC按1-2 x 106/ml的濃度懸浮于無血清培養(yǎng)液中，加入1,000 U/ml 的重組人IFN-g，37oC，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
2.224h 后加入50ng/ml 的CD3 單克隆抗體和300 U/ml 的重組人IL-2，刺激CIK 細胞的生長和增殖；
注：此時也可同時加入100 U/ml的重組人IL-1a。
2.3每3天半量換液或擴瓶一次，并補加重組人IL-2 300 U/ml；
2.4在培養(yǎng)的第14d，收獲CIK細胞。
2.5CIK細胞質(zhì)控：
2.9.1臺盼藍染色檢測：活細胞應(yīng)在80%以上；
2.9.2流式細胞儀檢測細胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表達：CD3+CD56+細胞的比例應(yīng)在20%以上。
2.9.3細胞殺傷實驗：以CIK細胞為效應(yīng)細胞，以腫瘤細胞（可為原代腫瘤細胞或腫瘤細胞株）為靶細胞，將效應(yīng)細胞與靶細胞按10 : 1（數(shù)目比） 的比例加入96 孔U 型板中，每孔含靶細胞1 x 104個，終體積為200 ml，設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)4h，然后取培養(yǎng)上清，用乳酸脫氫酶（LDH） 試劑盒檢測效應(yīng)細胞對靶細胞的殺傷率。
2.9.4收獲細胞前，取少量培養(yǎng)物進行細菌、真菌培養(yǎng)，并檢測支原體、衣原體，及內(nèi)毒素（標準：病原學(xué)檢測陰性，內(nèi)毒素<5 Eu）。
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