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PCR儀基因擴增儀的選擇

閱讀:2736發(fā)布時間:2010-8-16

PCR儀基因擴增儀的選擇

PCR原理
    DNA的半保留復(fù)制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈,在DNA聚合酶的作用下,以單鏈為模版,根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)制成新的單鏈,與模版配對成為雙鏈分子挎貝。在體外實驗中發(fā)現(xiàn),DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈,當溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此,通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性,并設(shè)計與模板DNA的5’端結(jié)合的兩條引物,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制,多次重復(fù)“變性解鏈—退火—合成延伸”的循環(huán)就可以以幾何級數(shù)大量擴增特定的基因。

    發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合酶對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義,該類酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,不需要每個循環(huán)加酶,使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時也大大降低了成本,PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用,并逐步應(yīng)用于臨床。

    從PCR原理可以看出,PCR儀的關(guān)鍵是升降溫的步驟?,F(xiàn)在偶爾還能聽到一些前輩們笑談早年的PCR實驗如何在3個水浴鍋中完成的趣聞。經(jīng)過不斷改進,今天的PCR已經(jīng)越來越完善和智能化。出于市場推廣的戰(zhàn)略需要,各廠家的PCR儀型號不同,著力宣傳的技術(shù)指標和參數(shù)也不盡統(tǒng)一,生物通的編者在這里簡單列出選購時我們認為應(yīng)該考慮的常用指標,希望有助于大家選購PCR儀的選購技巧。

PCR儀介紹及其選購
    PCR儀的種類總體來說可以分為兩大類:PCR擴增儀和實時熒光定量PCR儀,普通的PCR擴增儀又衍生出帶梯度PCR功能的梯度PCR儀、和帶原位擴增功能的原位PCR儀等等。1996年由ABI公司首先推出將擴增和檢測融為一體的實時熒光定量PCR儀

一、溫度控制
    對普通PCR儀來說,溫度控制指標主要是指溫度的準確性、均勻性、以及升降溫速度,對梯度PCR儀來說,除了溫度的準確性和均勻性、升降溫速度以外,還必須考慮儀器在梯度模式和標準模式下是否具有同樣的溫度特性。

    溫度的準確性是指樣品孔溫度與設(shè)定溫度的一致性,它直接關(guān)系到實驗的成敗。如果排除樣品加入過程中的問題,對于PCR反應(yīng)而言zui重要的莫過于溫度控制的準確性,由于PCR是一個幾何級數(shù)擴增的過程,擴增過程中退火溫度的細微變化會被放大而直接影響結(jié)果,不論是變性、退火還是延伸都需要準確控制溫度,對退火溫度而言溫控顯的尤為重要,有時1度甚至0.5度的差異也能決定實驗的成功與失敗,所謂差之毫厘,謬之千里。因而對PCR擴增儀而言溫度控制就意味著質(zhì)量。

    溫度的均勻性是指樣品孔間的溫度差異,它關(guān)系到在不同樣品孔進行反應(yīng)結(jié)果的一致性。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)有時用同樣的樣品,同樣的PCR反應(yīng)程序,zui后的結(jié)果竟然差異非常明顯,或許就是因為不同位置的溫度不均一性所致。一些使用過早期PCR儀的腦子格外靈光的研究人員偏愛使用PCR儀中間某幾個固定的孔,就是因為過往反復(fù)的教訓和認真的思索得出了這樣的結(jié)論,PCR儀的溫度均勻性不好,特別是zui外周的樣品孔情況更差,很有可能影響實驗結(jié)果——即“位置的邊緣效應(yīng)”會影響結(jié)果的可重復(fù)性。正是這種位置效應(yīng)對定量PCR的結(jié)果的影響更為明顯,所以后來才有Roche和Cobbett的離心式定量PCR的重大創(chuàng)新。  

    溫度控制除了度,還有一個廠家喜歡大力宣傳的指標——升降溫的速度。更快的升降溫速度,可以縮短反應(yīng)進行的時間,而且縮短了可能的非特異性結(jié)合、反應(yīng)的時間,能提高PCR反應(yīng)煌特異性。因此從本質(zhì)而言溫控方式就從以前相對穩(wěn)定耐用的機械式轉(zhuǎn)向了升降溫更快速的半導體。除了機械本身的原因,影響升降溫速度的還有制作承托樣品管的基座模塊的材料的導熱性。

    作為用戶來說,當然更愿意選擇升降溫速度快的,這就像汽車上好看的表面配置一樣容易看到,而內(nèi)在的穩(wěn)定性和耐用性往往是看不到的而容易被忽略。必須注意到,儀器的升降溫速度和樣品管中的樣品的升降溫速度并非同一回事,因為樣品管與基座接觸的緊密性、導熱性、鄰近樣品管的相互影響都會影響樣品的實際升降溫速度。

    現(xiàn)在的PCR儀一般具有兩種溫控模式,即模塊溫控模式(Block-control)和反應(yīng)管溫控模式)(tube-control)。在模塊溫控模式下,機器根據(jù)探se器直接探se的溫控模塊(即承載樣品的金屬臺)的溫度進行控制,這種模式適用于長時間的靜態(tài)孵育(如連接、酶切、去磷酸化等)。反應(yīng)管溫控模式實際上是一種模擬試管/PCR板的溫控模式,根據(jù)探se器所探測到的溫控模塊的溫度由計算機計算出管內(nèi)/PCR板孔內(nèi)樣品液的溫度來進行控制。一般說來,試管溫控更為準確,因為管內(nèi)樣品的溫度無法與溫控模塊同時達到預(yù)設(shè)溫度。特別是PCR反應(yīng)中的孵育過程一般都很短暫(30秒或更短),如果采用只有模塊溫控模式的話,反應(yīng)混合物孵育的時間與程序設(shè)定的時間會有相當大的差距。而反應(yīng)管控制的算法能自動補償時間,而且適合各種類型的反應(yīng)管,確保反應(yīng)混俁物按照程序設(shè)定的時間維持預(yù)設(shè)溫度。

       有的PCR儀廠家推出了另一種溫控方式;熱敏電極溫控模式。該方法將一個熱敏電極插入一個專門的測量管中(管中裝有礦物油),反應(yīng)進行時,將該測量管插入溫控模塊的樣品進行檢測。他們認為通過此途徑可以監(jiān)測反應(yīng)管內(nèi)樣品的實際溫度,但這種方法未免有些華而不實;(1)測量管中礦物油的溫度變化與實際反應(yīng)樣品的溫度變化未必一致;(2)因為測量管必須占用一個樣品孔,所以使用該溫控方式時就無法使用96孔PCR板作實驗。

 梯度PCR

    對于一個PCR反應(yīng),雖然有各種各樣的PCR引物設(shè)計軟件或者經(jīng)驗公式計算zui適的退火溫度,可是由于模版中堿基的組合千變?nèi)f化,對于特殊片斷,經(jīng)驗公式得到的數(shù)據(jù)不一定能"P"出來結(jié)果,細微的變化對結(jié)果都可能產(chǎn)生決定性的影響,因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問題。梯度PCR的出現(xiàn)部分解決了一些問題——在反應(yīng)過程中每個孔的溫度控制條件可以在范圍內(nèi)按照梯度變化,根據(jù)結(jié)果,一步就可以摸索出的反應(yīng)條件。不單退火溫度,連變性溫度和延伸溫度都可以優(yōu)化——對于多種聚合酶混合酶擴增如Invitrogen、Clontech、Promega的多數(shù)高保真Taq酶來說這個非常重要,因為Taq和校正酶的*反應(yīng)溫度可能有顯著差異,優(yōu)化延伸溫度就顯得很重要。多次實驗可在一臺儀器上完成,既節(jié)省實驗時間提率,又節(jié)省實驗成本。

    對于帶梯度功能的PCR儀,需要考慮梯度模式下不同梯度管排間的溫度均勻性和準確性,還必須考慮儀器在梯度模式和標準模式下是否具有同樣的溫度特性。這種差異可能導致在梯度模式下得出的*條件與標準模式下單獨做的結(jié)果出現(xiàn)差異。SteadySlope技術(shù)是eppendorf擁有的梯度PCR技術(shù),可以同樣的溫度變化速率到達所有設(shè)定的梯度溫度,所以在梯度模式下具有恒定的溫度性。這一技術(shù)保證了在梯度模式和普通模式之間可以進行可靠的信息傳遞,不會因為溫度特性不同而導致產(chǎn)量和特異性的變化。MJ公司沒有付費而選擇在梯度模式下采用不同的降溫速率,每個梯度溫度之間的溫度曲線不同,從梯度模式向普通模式進行轉(zhuǎn)換的可能會出現(xiàn)問題。此外采用TCT(三組回路)技術(shù)的梯度PCR儀由于在梯度PCR模式下增加了一個加熱和冷卻的控制區(qū)域,保證了梯度溫度控制的性并使不同梯度管排間的溫度均勻性更好。

    在PCR儀上增加原位PCR模塊就可以在玻片上進行原位PCR擴增,MJ和eppendorf的PCR儀都有提供原位適配器以滿足不同需要。購買配有支持原位PCR模塊的PCR儀對從事醫(yī)學研究的工作者是很值得的,一機兩用。

    此外,隨著基因組高通量研究的需求的提高,各品牌都推出了多槽式高通量PCR儀,各有特長:MJ有一種一拖四,就是1個主機帶4個擴增槽,每個槽可以獨立控溫,一次可以作96x4個樣品的PCR,不過一旦出現(xiàn)問題4個都不能用了。ABI則在原來的9700的基礎(chǔ)上推出了雙384孔的基座,一次完成384x2個樣品,使得9700的功能又擴展到高通量領(lǐng)域而無需購買新的機器,可惜兩個384槽不能獨立控溫。eppendorf則有一個控制面板,可以控制5個獨立的PCR儀,每臺機器可以聯(lián)合,而且互不影響,但是比較浪費空間。

 

二、儀器的功能性和人性化設(shè)計
    當然是越簡單方便的設(shè)計zui符合用戶的要求。

熱蓋——現(xiàn)在的PCR儀一般均配備熱蓋,熱蓋溫度設(shè)為105℃,使樣品管頂部的溫度達到105℃左右,蒸發(fā)的反應(yīng)液就不會產(chǎn)生凝集在管蓋上而改變反應(yīng)體積,這樣用戶就無需再向反應(yīng)管內(nèi)加石蠟油,直接減少后繼反應(yīng)的麻煩。如果是旋轉(zhuǎn)加壓的熱蓋就要特別小心,因為壓力到達時沒有明顯的提示,用戶需要根據(jù)經(jīng)驗將熱蓋旋到合適位置,不太容易掌握。如果過松,熱蓋沒有充分接觸反應(yīng)管而影響結(jié)果;如果過緊,則會導致反應(yīng)管變形,甚至可能造成熱蓋的機械故障。的ESP技術(shù)是指熱蓋加熱時不接觸樣品管,避免加熱樣品管導致非特異產(chǎn)物,等加熱到設(shè)定溫度后熱蓋下降,將樣品管壓入加熱模塊,下降時間和壓力都由電子控制。

樣品基座——PCR反應(yīng)多在0.2或者0.5的管子中進行,多數(shù)PCR儀也配備了不同的可更換樣品槽適配不同的樣品管。eppendorf有一個有趣的設(shè)計,一個槽內(nèi)帶有0.2和0.5兩種不同樣品孔,不需更換基座就可以分別使用兩種不同的反應(yīng)管,或者96孔板,加原位適配器就可以變成原位PCR了。避免了換基座的麻煩。當然不同的反應(yīng)管不可以同時使用的,因為高度不同,熱蓋不能作用。ABI的9700就可以更換不同的樣品槽,樣品槽系列擴增到從0.5到標準96孔,到雙384孔板,分別適合不同的需要,相當靈活。

軟件——新的PCR儀都比較注重程序編寫的簡易性。大屏幕,顯示實時信息,,記憶存儲多個程序、自動斷電保護等都有助于實驗室中的復(fù)雜環(huán)境使用。程序儲存方面,有人覺得儲存程序的多少似乎意義不太大,但是對于實驗人員多、PCR儀每天運作頻繁的實驗室來說,每個使用者獨立儲存自定義的PCR程序,確實能方便下一次的調(diào)用,會節(jié)約一些時間。


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