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上海酶聯(lián)生物研究所
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上海酶聯(lián)生物研究所
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閱讀：1310發(fā)布時(shí)間：2012-8-22
觀測(cè)RNA可為研究人員帶來(lái)許多新的認(rèn)識(shí)。存在于特殊細(xì)胞以及這些細(xì)胞特殊位點(diǎn)中的RNA可以揭示潛藏在差別背后的機(jī)制。在癌癥和其他疾病中，RNA轉(zhuǎn)錄物有時(shí)會(huì)被發(fā)現(xiàn)存在于錯(cuò)誤的地方。“這就是為什么大家會(huì)對(duì)RNA的定位感興趣的原因，然而RNA成像一直是一個(gè)挑戰(zhàn)，”威爾康乃爾醫(yī)學(xué)院從事RNA調(diào)控研究的Samie Jaffrey說(shuō)。
在過(guò)去的12個(gè)月里，RNA顯像能力解答了關(guān)于流感病毒如果包裝其基因這一長(zhǎng)達(dá)半世紀(jì)之久的爭(zhēng)辯，幫助揭示了H1N1 RNA是如何深入穿透肺組織的，揭露了令人驚訝的剪接動(dòng)態(tài)，證實(shí)了RNA轉(zhuǎn)錄物上的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)了轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性，證明了神經(jīng)元mRNA借助單個(gè)的顆粒運(yùn)輸?shù)搅藰?shù)突中。Jaffrey說(shuō)成像對(duì)于其他方式很難研究的調(diào)控性RNAs尤其重要，“了解非編碼RNA的定位有可能幫助我們了解它們的功能。”
生物化學(xué)、成像和標(biāo)記的進(jìn)步正在不斷擴(kuò)展研究人員能夠在單個(gè)細(xì)胞中觀測(cè)RNA的途徑?？煽俊⒎奖愕脑噭┈F(xiàn)在可在市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)到，用于在各種情況下標(biāo)記固定細(xì)胞中的RNA。在活細(xì)胞中研究RNA轉(zhuǎn)錄物的技術(shù)更具挑戰(zhàn)性，但它們也在不斷擴(kuò)展和改良。
RNA FISH在固定細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)單分子
原位雜交（FISH）是通過(guò)利用附著熒光染料或其他標(biāo)記物的互補(bǔ)寡核苷酸組成的轉(zhuǎn)錄物特異性探針來(lái)揭示RNA。報(bào)道RNA熒光原位雜交是在上世紀(jì)80年代，其操作困難且應(yīng)用有限。然而這一曾經(jīng)了不起的藝術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)成為了一種方便的技術(shù)。
如果某些商家的希望被實(shí)現(xiàn)，在細(xì)胞內(nèi)成像RNA轉(zhuǎn)錄物將成為像蛋白質(zhì)免疫染色一樣的常規(guī)的技術(shù)。臨床診斷公司Advanced Cell Diagnostics的執(zhí)行官Yuling Luo說(shuō)在基于抗體的蛋白質(zhì)標(biāo)記存在問(wèn)題的地方RNA標(biāo)記有可能實(shí)現(xiàn)。他解釋說(shuō)因?yàn)橛锌赡軣o(wú)法獲得適合的抗體，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或定位有可能阻礙標(biāo)記或是標(biāo)記一種蛋白的條件或許不適于標(biāo)記另一種。相反，*不同蛋白質(zhì)的RNA轉(zhuǎn)錄物都可以在相同的分析條件下進(jìn)行檢測(cè)。Luo和其他人希望將RNA轉(zhuǎn)錄物作為生物標(biāo)記的應(yīng)用將不斷增多。
RNA成像也可以解答基因表達(dá)譜研究提出的一些問(wèn)題。曾經(jīng)科學(xué)家們追蹤過(guò)一些轉(zhuǎn)錄物開(kāi)展進(jìn)一步的研究。RNA原位雜交可以顯示基因如何在整個(gè)細(xì)胞群中表達(dá)，在同一個(gè)細(xì)胞中哪一對(duì)轉(zhuǎn)錄物一起增高和下降，一種轉(zhuǎn)錄物是否定位在特異的細(xì)胞類(lèi)型中或是像樹(shù)突這樣的特殊區(qū)室內(nèi)。原位雜交還可以證實(shí)RNA干擾研究中一種轉(zhuǎn)錄物是否確實(shí)受到了抑制。
麻省理工學(xué)院和Hubrecht 研究所系統(tǒng)生物學(xué)家Alexander van Oudenaarden 說(shuō)RNA FISH研究的一個(gè)巨大推動(dòng)力就是越來(lái)越多的人對(duì)細(xì)胞所包含的驚人的異質(zhì)性感興趣。“如果你忽視細(xì)胞的個(gè)體性，在一根試管中將它們混合到一起，你zui終獲得的將是實(shí)際上不存在的平均個(gè)體。”他提供了一個(gè)可口的比喻：只是品嘗沙沒(méi)有人能夠?qū)W會(huì)區(qū)分芒果、香蕉或草莓不同的口味。相鄰的細(xì)胞可能剛好不同，檢測(cè)它們需要分辨單細(xì)胞基因表達(dá)。
van Oudenaarden利用RNA FISH在小鼠腸冰凍切片上顯示了作為三種類(lèi)型干細(xì)胞標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄物在隱窩中的分布。腸隱窩常被用于研究再生和分化。利用原位RNA，可以快速挑選出大量的標(biāo)記物，組合觀測(cè)它們看看哪些*地識(shí)別了不同的細(xì)胞類(lèi)型;用熒光蛋白標(biāo)記完成同樣的事情將是不太可能或不切實(shí)際的。van Oudenaarden.說(shuō)：“無(wú)需遺傳修飾任何東西，你就可能獲得大量的進(jìn)展。這相當(dāng)?shù)娜菀?。我們開(kāi)玩笑說(shuō)我們甚至不是生物化學(xué)家。”他說(shuō)難的是設(shè)計(jì)成像系統(tǒng)和相應(yīng)的軟件。
*個(gè)普遍應(yīng)用的RNA FISH探針是利用質(zhì)粒來(lái)生成反義RNA，其摻入的修飾核苷酸結(jié)合到了隨后可以被標(biāo)記的抗體上。阿爾伯特愛(ài)因斯坦醫(yī)學(xué)院的Robert Singer實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建出了另一種方法，用酶將熒光核苷酸類(lèi)似物摻入到長(zhǎng)雙鏈DNA分子。他們后來(lái)改良了這一技術(shù)利用幾組更小的合成DNA探針，每種探針大約50個(gè)核苷酸長(zhǎng)，標(biāo)記著一些小分子熒光基團(tuán)。
Tyagi說(shuō)利用更短的、逐個(gè)衍生的探針在固定細(xì)胞中生成RNA標(biāo)記更易于處理。“這是一個(gè)簡(jiǎn)單的步驟可以解決大問(wèn)題。由于寡核苷酸合成已經(jīng)變?yōu)樽詣?dòng)化，你可以在96孔板中生成寡核苷酸。”他補(bǔ)充說(shuō)更多更小的探針提供了其他的利益。例如，一種探針的結(jié)合松解了轉(zhuǎn)錄物使得其他的探針更易于結(jié)合。并且并不是每個(gè)探針都需要是的，“你得到的是所有或大多數(shù)探針結(jié)合的信號(hào)，非不是一個(gè)或兩個(gè)錯(cuò)誤結(jié)合的信號(hào)。”
Biosearch Technologies公司在去年9月推出了短的逐個(gè)標(biāo)記的探針Slaris FISH。在研究人員在線(xiàn)輸入他們需要的轉(zhuǎn)錄物的序列后，公司的軟件會(huì)設(shè)計(jì)出數(shù)組多達(dá)48種探針來(lái)標(biāo)記它。Biosearch提供8種熒光基團(tuán)選擇，從藍(lán)色到紅色，研究人員也可以購(gòu)買(mǎi)為標(biāo)記的衍生探針，自己添加熒光基團(tuán)。例如，van Oudenaarden將特異的基團(tuán)附著到了波譜的紅色端，從而可以與藍(lán)色的核及綠色標(biāo)記的蛋白一并成像。Tyagi在同一套探針內(nèi)利用兩種不同的基團(tuán)檢測(cè)了RNA加工事件，例如選擇性剪接形式。相似的方法可以鑒別融合基因。
這種方法被van Oudenaarden'的前博士后Arjun Raj進(jìn)一步改良，他和新澤西醫(yī)學(xué)與牙科大學(xué)的Sanjay Tyagi設(shè)計(jì)出了更短的用于RNA FISH的寡核苷酸。這一系統(tǒng)利用數(shù)組約50種左右的探針，每種靶向轉(zhuǎn)錄物不同的部分。這些探針大約20個(gè)核苷酸長(zhǎng)，用單個(gè)熒光基團(tuán)修飾，更易于穿透細(xì)胞，相比于長(zhǎng)探針制造更便宜更快速。然而，這種策略不能靶向短于約800個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄物，因?yàn)檩^少標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄物很難看見(jiàn)。
Biosearch Technologies 公司企業(yè)發(fā)展部主任Marc Beal 說(shuō)5納摩爾的混合定制寡核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)定價(jià)為575美元，足夠進(jìn)行500-2000次反應(yīng)。Beal說(shuō)該系統(tǒng)可以與各種熒光顯微鏡包括廣野顯微鏡和共聚焦顯微鏡一起使用，可用于冰凍、石蠟包埋組織樣品以及培養(yǎng)細(xì)胞。采用油浸透鏡可將“RNA點(diǎn)”放大60-100倍。Biosearch也正在開(kāi)發(fā)一種可自動(dòng)分析的成像系統(tǒng)。
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