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上海酶聯(lián)生物研究所
上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：462發(fā)布時間：2011-10-24
（一） 原理
免疫電鏡技術(shù)是免疫化學(xué)技術(shù)與電鏡技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物，是在超微結(jié)構(gòu)水平研究和觀察抗原、抗體結(jié)合定位的一種方法學(xué)。它主要分為兩大類：一類是免疫凝集電鏡技術(shù)，即采用抗原抗體凝集反應(yīng)后，再經(jīng)負(fù)染色直接在電鏡下觀察；另一類則是免疫電鏡定位技術(shù)。該項技術(shù)是利用帶有特殊標(biāo)記的抗體與相應(yīng)抗原相結(jié)合，在電子顯微鏡下觀察，由于標(biāo)準(zhǔn)物形成一定的電子密度而指示出相應(yīng)抗原所在的部位。免疫電鏡的應(yīng)用，使得抗原和抗體定位的研究進入到亞細(xì)胞的水平。
（二）影響免疫電鏡的一些因素
1．標(biāo)記物
用于電鏡觀察的標(biāo)記物有三類：一類是電子密度致密的標(biāo)記物，如鐵蛋白、辣根過氧化物酶等。另一類則是放射性同位素，如135I、35S、32P、14C、3H等，第三類則是有*形狀的標(biāo)記物，如血蘭蛋白、噬菌體等。
對標(biāo)記物的要求是：具有特定的形狀、不影響抗原抗體復(fù)合物的特性與形狀。目前用于免疫電鏡的標(biāo)記物主要是鐵蛋白和HRP。兩者各有其優(yōu)點，鐵蛋白電子密度致密。觀察時反差大，優(yōu)于酶標(biāo)記，但鐵蛋白分子量大（460
000），穿透能力差，所以適于細(xì)胞表面抗原的定位，另外鐵蛋白的標(biāo)記過程比較復(fù)雜。HRP分子量?。?0
000），穿透力強，有利于標(biāo)記抗體進入細(xì)胞內(nèi)，適于細(xì)胞內(nèi)的抗原定位。
2．固定劑
固定是免疫電鏡較關(guān)鍵的一步，免疫電鏡中的固定與一般超薄切片中的固定的不同之點在于既考慮保存細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu),又要考慮到抗原的失活性問題。
（1）
固定劑的要求：①不損害細(xì)胞內(nèi)抗原的活性；②固定速度快、效果好；③分子量小，易于滲透；④固定后,不引起交聯(lián)，造成空間的阻礙，影響標(biāo)記抗體進入抗原位。
（2）
影響固定的因素有：①采用固定劑的種類；②固定劑的濃度，濃度過大，對抗原的活性有影響，濃度過小，固定效果差；③固定劑的pH；④固定劑的溫度,一般采用2℃～4℃冷固定；這樣能降低細(xì)胞的自浴作用和水分的抽提；⑤固定時間與溫度有關(guān)，溫度高，固定快，也與緩沖系的離子強度有關(guān)，離子強度大，滲透壓大，穿透力強，固定要快。不同的固定劑，或同一固定劑的不同濃度所需的固定時間也不一致；⑥與被固定的細(xì)胞類型有關(guān)。
目前常用的固定系統(tǒng)有：4%聚甲醛，1.5%～2%戊二醛，1%多聚甲醛＋1%戊二醛，4%多聚甲醛＋0.5%苦味酸＋0.25%戊二醛，96%乙醇＋1%醋酸。不論采用哪些系統(tǒng)，使用前必須用已知效價的抗原做一系列預(yù)實驗。如固定劑的種類濃度、溫度、pH及固定時間等。然后做出預(yù)處理的效價，作為失活參考以再選擇zui適條件。
3．非特異性吸附
非特異性吸附與酶標(biāo)抗體、抗血清的稀釋度、染色時間，溫度及介質(zhì)等有關(guān)，其中zui主要的是抗血清及標(biāo)記抗體的稀釋。一般認(rèn)為價抗血清或標(biāo)記抗體稀釋到低蛋白濃度，用于標(biāo)記染色可獲得的結(jié)果。因為低蛋白濃度有利于降低非特異性吸附。實際應(yīng)用的蛋白濃度大致在0.50mg/ml～2mg/ml。工作效價一般在1︰20～1︰400,在實際工作中，將標(biāo)記抗體或抗血清稀釋到1︰100倍以上則可獲得理想的陽性結(jié)果，而非特異性吸附必然降得很低。
工作濃度的選擇是將標(biāo)記抗體或抗血清作1︰2、1︰4、1︰8……1︰256的稀釋，做已知陽性標(biāo)本的標(biāo)記染色觀察，取其陽性沉積物明顯，而非特異性吸附zui低的一稀釋度做為工作濃度。
4．標(biāo)記染色法
標(biāo)記染色法分為直接染色法與間接染色法兩種。前者的特點是特異性較高,敏感性低，標(biāo)記抗體只能用于檢測一種抗原。后者敏感性較強，一種標(biāo)記抗體可用于多種抗原的檢測。缺點是特異性較差。
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